腺病毒介导存活素rna干涉对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用论文

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1、腺病毒介导存活素RNA干涉对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用论文谢富华,王润秀,李莉萍，覃燕梅，梁念慈【摘要】目的：研究腺病毒介导的RNA干涉（RNAinterference,RNAi）沉默存活素（Survivin）表达后，对MCF7细胞裸鼠人乳腺癌移植瘤的抑制作用.方法：构建携带survivinshRNA表达质粒的腺病毒Adsurvivin，并检测其滴度；建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型；将重组腺病毒悬液行瘤周和瘤体注射，观察肿瘤生长情况；剥离瘤体称重并计算药物的抑瘤率；免疫组织化学检测Survivin蛋白表达情况.结果：成功建立人乳腺癌肿瘤模型，移植瘤成功率为90%

2、（18/20）；给药后实验组移植瘤的生长速度慢于对照组；病理学检查为浸润性导管癌；剥离肿瘤组织称重发现实验组抑瘤率为28.89%（P0.05）；免疫组化发现实验组Survivin蛋白表达区的吸光度值为（15.63±1.54），明显低于阴性对照组（30.45±6.72）和空白对照组（30.25±6.58）.freelbion公司）；小剂量腺病毒纯化试剂盒（广州展晨生物技术有限公司）；免疫组织化学检测试剂盒，SurvivinmAb（北京中杉金桥生物技术有限公司）.1.2方法1.2.1重组腺病毒的构建与纯化将前期实验中构建的survivinshRNA表达质粒和阴性对照质

3、粒，按pSilenceradeno1.0CMV试剂盒与腺病毒纯化试剂盒说明书构建并纯化重组腺病毒,分别命名为Adsurvivin和Adcontrol.1.2.2重组腺病毒滴度测定采用文献［6］的微量全细胞病变法检测病毒滴度.取96孔板，每孔加入1×104HEK293细胞，加培养液200μL，置孵箱培养24h.待测病毒用DMEM全培养基稀释至10-2，10-3，10-4，10-5，10-6及10-7的稀释度病毒液体，吸去上清后，分别加入每个稀释度的病毒液体，每孔200μL，每孔均设复孔，同时设培养基对照(不含腺病毒).37℃，50mL/LCO2条件下继续培养

4、36～48h.镜下观察完全细胞病变现象，按以下公式计算滴度.滴度（pfu/mL）=（接种细胞数×稀释度×10）/加入的病毒体积（mL）.1.2.3人乳腺癌模型的建立按照文献［7］的方法，将MCF7细胞0.1mL(1×1010～5×1010细胞/L)接种于裸鼠右前肢腋下，待瘤径达0.5cm左右时随机分组，每组6只.瘤内及瘤周同时注射0.1mLAdsurvivin，Adcontrol或PBS［参照文献［8-9］的方法，病毒量为1×108pfu/（只·次）］，1次/3d，共9次.用游标卡尺测量瘤体长径（a）和短径(b)，按公式计算移植瘤体积.移植瘤体积（V，mm3

5、）=πab2/6计算，观察3L.2.2移植瘤生长情况接种乳腺癌MCF7细胞株后11d，于接种处可见微小突起，以后逐渐明显.接种后17d，有18只裸鼠移植瘤体积均超过100mm3，接种成功率为90%.接种后17，20，23，26d，Adsurvivin组的移植瘤体积与Adcontrol组和PBS组的无明显区别.接种后29d，Adsurvivin组的移植瘤体积（210.59±4.25）mm3小于Adcontrol组（365.04±14.13）mm3和PBS组（412.2±8.90）mm3，但三组间的差异无统计学意义（P0.05）.接种后32d，Adsurv

6、ivin组的移植瘤体积（288.02±5.22）mm3明显小于Adcontrol组（516.08±11.79）mm3和PBS组（625.25±50.95）mm3，差异均有统计学意义（P0.05，图1）.图1给药后各组肿瘤生长曲线2.3移植瘤组织病理学观察移植瘤呈椭圆形或分叶状生长（图2），质地硬，切面灰白.光镜下可见移植瘤细胞形状不规则，大小不均一，核大浓染，核异形性明显，有病理性核分裂像，核浆比例明显增大.各组裸鼠的肝、肺脏组织未见损伤和瘤细胞转移（图3）.2.4siRNA药物的抑瘤作用接种后35d处死裸鼠，剥离瘤体称重发现：Adsurvivin组瘤体质量为

7、（0.32±0.04）g，低于PBS组（0.45±0.06）g和Adcontrol组（0.41±0.06）g，其差异具有统计学意义（P0.05），表明Adsurvivin组肿瘤细胞增殖受到抑制，抑制率为28.89%；而Adcontrol组和PBS组间的差异无统计学意义（P0.05）.2.5移植瘤组织Survivin蛋白表达免疫组化结果显示（图4），Survivin抗原表达于移植瘤细胞质内，阳性细胞呈棕黄色或棕褐色.Motic医学图像分析各组棕黄色或棕褐色区域的累积吸光度值，Adsurvivin组为（15.63±1.54），低于PBS组（30.45±6.72

8、）和Ad