抗蓖麻毒素双可变区抗体的构建和机制研究

《抗蓖麻毒素双可变区抗体的构建和机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、第二军医大学硕士学位论文抗蓖麻毒素双可变区抗体的构建和机制研究姓名：张天成申请学位级别：硕士专业：肿瘤学指导教师：寇庚201205抗蓖麻毒素双功能抗体的功能和机制研究摘要蓖麻毒素是存在于蓖麻籽油【}I的植物毒素。这种毒索由A和B两个亚基组成，并通过一条二硫键连接在一起。蓖麻毒素B亚基是一种半乳糖特异性的凝集素，能够结合细胞表面含糖脂或糖蛋白的受体。这些结合的毒素随后通过宿主细胞依赖的内化机制和从内吞小体向内质网的内质网逆向运输机制被运入细胞质。在进入内质网后，蓖麻毒素必须在蛋白质-硫键异构酶(PDI)的作用下，将A，B亚基间的二硫键还原，此后

2、A亚基才能露出其酶活性位点。当R]rA转移到达细胞质后，它的糖苷酶活性位点能够识别rRNA上高保守的Q．sarcin环，阻碍多肽延伸并导致细胞的死亡。因为其具有高致死和易于散播获得的特性，蓖麻毒素被认为是一种可能被用于生化攻击的生物战剂。目前，尽管已经有许多中针对这一威胁的治疗方法以及被发展出来，但特异性的抗体治疗仍旧是一种最特异和最高效的治疗方法。之前曾经有报道称两株或更多单克隆抗体的联合使用能够增加抗体的保护效果，同时，我们在制备抗蓖麻毒素肇克隆抗体的过程中也发现了类似的现象。当我们将两株抗R]rA的单克隆抗体6C2和抗RTB的单克隆抗体

3、3El联合使用后，我们发现抗体的在体内和体外的保护水平部得到了提高。在过去十年中随着对传统抗体临床知识的成熟，人们丌始试图发展ff{F一代抗体以期提高抗体的效果。下一代抗体的种类有许多，而双特异性抗体是其中最受重视的一种。双特异性抗体一个火键的能力是能够一个分子同时中和保护两个不同的目标，例如配体，受体，或细胞因子。除此之外，双特异抗体还能通过识别一个抗原分子上的不同表位来增加抗原特异性和保护效果。在我们的课题中，我们设计了一种含有6C2和3El可变区和人Fc区的双特异性抗体，具有⋯个臂结合两个抗原的能力，我们称之为DVD抗体。在随后的工作中

4、，我们证实这种新的DVD抗体保留了亲源抗体所有的特性和功能：包括识别R]rA和lHB的能力，阻碍R1’A酶活‘

5、，￡的能力，阻碍l玎B结合细胞表面糖蛋白和糖脂的能力。细胞毒性实验和小鼠保护实验显示DVD抗体，其保护作用有Ⅲj512的提高：比单个抗体的保护效果至少多了10倍，甚至比嵌合的6C2和3El的联合使用效果还好了3倍。结合棚同表位的抗体的效果。般被认为与抗原抗体之间的亲和力有关。然而，和我们的发现不同的足，DVD抗体和6C2抗体，3E1抗体的动力学参数之问并没有特别人的芹别。所以，蟊i此后的研究中我们合理的质疑DVD抗体I叮能还通过⋯些

6、je他我们所／fi欠

7、l道的机制保护机体免受毒素攻。lj。RICIN发挥作川的必篮条什是细胞质-}，游离R1’A的存相：。个毒索n：内质p69中阳内质}叫外释放R’rA的过柠tf-，PI)I对R，I'A．RTIjM。：硫键的解离址je天键步骤。I)VI)平【J两株f‘统Irf{J币．免隆机体之11IJ最人的艿：别是他能够川·个抗体佻¨时抓化R，I’人和第二军医大学硕士学位论文R1’B。随后，我们在无细胞体系中用westemblot和SRP分析证实了DVD抗体能够导致链间二硫键无法被还原。除此之外，还有一个明显的证据就是DVD抗体能够使觚A在内

8、质网中滞留，而其他的抗体包括6C2和3E1抗体的联合应用都不能引起相同结果。基于以上结果，我们认为当DVD抗体和毒素一起被吸收进入内质网时，二硫键被PDI还原的过程被DVD干扰了。这应该是DVD抗体动力学数据和单个抗体类似，但保护效果优-J：其他抗体的合理解释。关键字：蓖麻毒素双特异性抗体双功能抗体蛋白质二硫键异构酶抗蓖麻毒素双功能抗体的功能和机制研究AbstractRicinisakindofplanttoxinproducedintheseedsofthecastoroilThetoxinconsistsoftwosubunits(Aan

9、dB)linkedbyadisulndebridge．TheB—chain(R『rB)isagalactose-specinclectinwhichbindstothecelIsurface．Thesebindingtoxinsdependonhostcellmachine叮forintemalization，retrogradetra伍ckingfromendosomestotheER．InendoplaSmicReticulum，A—chain(fU’A)can’lreIeaseastericactiVesiteunlesstheinte

10、rchaindisuIndebondsarereducedbyProteindisulphide—isomeraSe(PDI)．whenR1’Aistr蚴sloca