抗蓖麻毒素单克隆抗体6c2中和保护作用的结构基础及机制

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1、第二军医大学硕士学位论文抗蓖麻毒素单克隆抗体6C2中和保护作用的结构基础及机制StructureBasisandNeutralizingMechanismofMonoelonalAntibody6C2againstRicin专业名称：肿瘤学研究生姓名：夏天导师姓名：戴建新教授培养单位：第二军医大学肿瘤研究所导师组成员：郭亚军教授王皓研究员赵健研究员李博华研究员李威研究员论文工作时间：2010年9月至2013年5月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发

2、表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：钦日期：2d弓年臼／日学位论文版权使用授权声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文储始锨日期：2口侈年上月／日导师签名日

3、期：29目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一l—Abstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．一3一缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．一5一前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．一6一第一部分抗蓖麻毒素单克隆抗体的筛选和体内外中和保护作用研究⋯⋯．．一7一一、实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．一7一二、实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．一8一三、实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一13一四、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．一20一第二部分6C2抗体识别表位鉴

4、定及RTA-6C2Fab共结晶的结构解析⋯⋯．．一21一一、实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一21一二、实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一25一三、实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一30一四、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．一38一第三部分单克隆抗体6C2中和保护作用的结构基础和机制⋯⋯⋯⋯⋯一40一一、实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一40一二、实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一4l一三、实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一45一四、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯．一51一全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一53一参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一54一综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．一57一在读期间发表论文和参加科研工作情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．一64一致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．一65—抗蓖麻毒素单克隆抗体6C2中和保护作用的结构基础及机制摘要蓖麻毒素(Ricin)是存在于蓖麻籽油中的植物毒素。由A和B两个亚基组成，并通过一条二硫键连接在一起。蓖麻毒素B亚基(RTB)是一种半乳糖特异性的凝集素，能够结合细胞表面含糖脂或糖蛋白的受体。这

6、些结合的毒素随后通过宿主细胞依赖的内化机制和从内吞小体向内质网的逆向运输机制被运入细胞质。当蓖麻毒素A链(RTA)转移到达细胞质后，它的糖苷酶活性位点能够识别rRNA，阻碍蛋白质合成过程中的多肽延伸并导致细胞的死亡。因为其具有高致死和易于获得的特性，蓖麻毒素被认为是一种可能被用于生化攻击的生物战剂。目前，尽管已经发展出了多种针对蓖麻毒素的治疗方法，但特异性的中和抗体治疗蓖麻毒素中毒仍旧是一种最特异和最高效的治疗方法。尽管目前已经发现了许多抗蓖麻毒素的中和保护性抗体，其中和保护作用的机制往往仅局限于对己知功能表位的阻断性抑制的探讨。对于中和保

7、护性抗体发挥中和保护作用的结构基础则知之甚少。本研究筛选得到5株抗蓖麻毒素A链单克隆中和抗体，其中6C2在蛋白质合成抑制试验，vero细胞体外保护实验和小鼠体内保护实验中表现出很好的中和保护活性。有趣的是我们经抗原表位淘选，发现其结合表位与已经报道的酶催化活性位点相距甚远。为明确6C2中和抗体的结合表位以及中和保护机制。我们进行了6C2Fab—RTA的共结晶实验。在3．0埃水平上解析了中和抗体6C2Fab和RTA复合物的共结晶的X射线衍射结构。抗体6C2高变区上的H1、H2、H3和L1形成了一个“口袋”，与RTA上的a螺旋相互作用。通过对R

8、TA的点突变发现，Q98，E99，E102，T105是抗体6C2与RTA结合的关键位点。但SPR和pulldown实验证实，抗体6C2的结合仅能够降低RTA与核糖体的亲和力。我们