广西csfv地方株的分离、全基因序列测定分析和致病性研究

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1、广西大学硕士学位论文广西CSFV地方株的分离、全基因序列测定分析和致病性研究姓名：张民秀申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：黄伟坚201206广西CSFv地方株的分离、全基因序列测定分析和致病性研究广西OSln／地方株的分离、全基因序列测定分析和致病性研究摘要本实验通过采集广西各地临床上疑似猪瘟的组织病料，经RT-PCR方法鉴定为阳性后接种到PKl5细胞，采用带毒传代的方法分离到两株猪瘟病毒GXGP03和GXLCl5。对这两株进行全基因克隆并测序，GXGP03和GXLCl5株全长分别是1

2、2295bp和12296bp。GXGP03和GXLCl5经序列分析发现，与HCLV、Shimen株的同源性较低，为84．2％N85．5％；与Paderborn、GXWZ02株的同源性为94．2％-94．9％。进化树分析表明，GXGP03和GXLCl5都属于Subgroup2．1，与Paderborn、GXWZ02属于同一个亚群，亲缘关系较近，与HCLV株、Shimen株亲缘关系较远，并且根据GXLCl5和GXGP03株的全基因组及各个基因进行进化树的构建，发现Erns基因、NS3、NS4B、NS

3、5A的进化树中显示的基因分群与全基因组、E2基因、NS5B进化树中的基因分群基本相似，故推测着几个基因可成为基因分群依据的潜在性基因。通过与HCLV、India疫苗株、Shimen、Shimen—HVRI、Paderborn、GXWZ02株的3，．UTR序列比较发现，GXGP03和GXLCl53，．UTR与强毒株Shimen、Shimen．HVRI及中等毒力株Paderborn、GXWZ02株一样缺失14个碱基。将40株毒株与GXGP03株、GXLCl5株的Erns、E2蛋白进行氨基酸序列比较。

4、分析Erns、E2糖基化位点，发现不同亚群毒株的糖基化位点存在差异，主要存在在数量上的差异，这是否与毒株的毒力相关，需要进一步研究。分析GXLCl5和GXGP03株的Erns氨基酸序列，发现第476位广西大掌硕士论文广西CSF＼r地方株的分离、全基因序列测定分析和致病性研究氨基酸位点都为为Ser，没有发生变异，表明了GXLCl5和GXGP03以非乙酰硫酸肝素的方式在PKl5细胞上增殖。动物实验表明，GXLCl5和GXGP03株对猪具有明显的致病性，在临床症状上表现为皮肤出现出血点和出血斑、腹泻、

5、体温升高等症状，剖检后发现脾脏边缘梗死并呈锯齿状、肠系膜淋巴结出血、肿胀、肾点状出血、膀胱点状出血、腹股沟淋巴结出血、切面呈大理石花纹样等猪瘟典型症状。应用定量PCR对GXGP03攻毒后猪的分泌物、排泄物、血清进行CSFV的检测，发现猪在感染第6天出现病毒血症，并且在感染后第乱10天，在分泌物和排泄物中检测到CSFV病毒，说明CSFV在攻毒后第6~10天开始排毒。通过实验分析CSFV毒株毒力的强弱与白细胞变化、体温变化、临床症状、排毒情况有关。本实验中GXGP03和GXLCl5感染猪只后自细胞数

6、量在第4天开始减少，抗体在第4~第lo天迅速上升，抗体滴度超过1：1024，并且白细胞数量的减少和抗体滴度的升高总是出现在体温升高、产生病毒血症、皮肤出血等临床症状之前。攻毒后组织病理变化显示，GXGP03感染猪只后，产生严重病理变化的为脾脏和肺脏。根据动物实验的临床症状、病理变化、结合GXGP03和GXLCl5的分子生物学特性可判断GXLCl5和GXGP03株是中等毒力的毒株，病程呈亚急性经过。关键词：猪瘟病毒全基因遗传进化序列分析基因分型致病性实时定量PCRGENOMICSEQUENCING

7、ANALYSISANDPATHOGENICITYTESTOFCSFvINGUANGXIABSTRACTClinicaltissues锄plesofsuspectedclassicalswinefever(csF)locallycollectedfr伽GuaIlgxidistrictswereprimarilydetectedusingI汁PcRtecIlniquesandpositivesampleswereinoculatedinPK_15andculturedforvirusisolatio

8、n．TwostrainsrespectivelynamedGXGP03andGXLCl5wereisolatedandtheirgenomeswereclonedandsequencedresultingin12295bpand12296bpinlength．AnalysisoftwoisolatescomparedwithItChV，Shimen，Paderborn，GxWZ02strains，revealedthatthehomologywas84．2％“85．5％withttCLVandS