喉鳞癌microrna表达谱变化及mir-125b对喉癌hep-2细胞增殖影响的研究

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复旦大学博士学位论文喉鳞癌microRNA表达谱变化及miR--125b对喉癌Hep--2细胞增殖影响的研究姓名：曹鹏宇申请学位级别：博士专业：耳鼻咽喉科学指导教师：周梁2012-03-25 复旦大学博士论文中文摘要第一部分喉鳞癌mieroRNA表达谱变化及候选靶基因分析背景：microRNA(微小RNA，简称miRNA)是一种非编码RNA，在恶性肿瘤的基因表达转录后调节中发挥作用。本部分研究miRNA在喉鳞癌组织中表达谱变化，为LSCC研究提供了新的方向。方法：通过激光显微切割技术(LCM)分离6例喉癌组织肿瘤细胞，采用miRNA芯片筛查喉癌组织与癌旁正常组织中miRNA表达谱变化，在48对喉癌组织及癌旁正常组织中，采用实时定量PCR技术验证miRNA芯片结果，通过生物信息学软件预测这些差异表达miRNAs的靶基因，在24对喉癌组织中检测候选基因的表达水平。结果：通过miRNA芯片检测，筛查得到29个差异表达的miRNAs，经过实时定量PCR验证后，有6个被证实包括表达上调的miR．21、miR-93、miR-205和miR一708，表达下调的miR．125b和miR．145。使用软件预测共有25个候选靶基因，经检测后有10个候选基因在LSCC中表达水平有差异。结论：这些差异表达的miRNA在喉癌的发生和演进过程中可能发挥了重要作用，并且为miRNA的功能研究提供了方向。第二部分miR．125b通过EIF2C2抑制喉癌I-Iep．2细胞增殖背景：失控的自主性增殖是恶性肿瘤细胞具有的主要特征之一，细胞周期控制紊乱导致肿瘤细胞增殖调控异常。本部分在体外和体内水平研究上调miR-125b对喉癌Hep一2细胞增殖的影响及机制。方法：采用慢病毒载体构建miR．125b表达载体，感染Hep．2细胞后建立能够稳定高表达miR-125b的稳转细胞株Hep．2-miR-125b和对照细胞株Hep．2-vector，WST-1实验检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞周期和凋亡变化。并将Hep．2．miR．125b和Hep．2．vector细胞接种NOD／SCID小鼠，观察小鼠移植瘤生长情况。采用双荧光素酶报告基因检测系统初步验证EIF2C2(eukaryotictranslationinitiationfactor2C．2，真核转录起始因子2C．2)是miR．125b的靶基因，在两株细胞中检测候选基因EIF2C2mRNA表达和蛋白水平变化。结果：Hep．2-miR-125b能够稳定、高水平表达miR．125b，miR-125b过表达后能够抑制Hep．2细胞的增殖能力，抑制NOD／SCID小鼠体内成瘤能力，使Hep．2细胞停滞于GO．G1期，凋亡没有变化。双荧光素酶报告基因检测系统显示miR．125b能够抑制EIF2C2载体40％的荧光素酶活性，验证EIF2C2是miR-125b的靶基因，并在mRNA 垄兰苎兰塑兰兰璺二—一一生塞垫墨——————————————————————————————————————————————————————————一．I^JH．K水平和蛋白水平上进一步证实miR．125b可以抑制EIF2C2的表达。结论：上调miR-125b通过靶向EIF2C2抑制喉癌H印．2细胞增殖，本研究为以miR．125b作为靶点治疗喉癌提供了一定的理论依据。关键词：喉鳞癌、microRNA、靶基因、增殖、细胞周期、EIF2C2中图分类号：R739．654 复旦大学博士论文英文摘要AbstractPartoneComprehensiveexpressionprofilingofmicroRNAsinlaryngealsquamouscellcarcinomaandscreeningoftargetgenesBackgroundMicroRNAs(miRNAs)arenon-codingRNAsinvolvedinpost-transcriptionalregulationofgeneexpressionincancerand，providenewperspectivesonthedevelopmentoflaryngealsquamouscellcarcinoma(LSCC)．Methods．LasercapturemicrodissectionWasappliedtoisolateahomogeneousgroupofcellsfromsixLSCCsamples．miRNAexpressionofsixpairsofLSCCandadjacentnormaltissuesWasscreenedusingmiRNAarray．TheresultsofmiRNAarrayanalysiswerevalidatedin48pairsofLSCCandaajacentnormaltissuesusingquantitativerealtime-PCR．Theputativetargetgeneswerepredictedusingthreeon-linebioinformationsoftwareprogramsandtheirexpressionofmRNAweredetectedviaquantitativerealtime—PCRin24pairsofLSCC．Results．Twenty．ninedifferentiallyexpressedmiRNAsweredetectedinthesixpairsofLSCC，ofwhichsixwereconfirmed，includingupregulationofmiR-21，miR-93，miR-205，andmiR．708anddownregulationofmiR-125bandmiR-145usingqRT-PCR．25putativetargetgeneswerepredictedusingthreeon—linesoftwareprogramsandtheirrnRNAexpressionoftentargetgeneswereconfirmedinlargecohortsamples．Conclusion．ThesedifferentiallyexpressedmiRNAsmayplayamajorroleintumorigenesisandprogressioninLSCCandoffernewanglesforfurtherinvestigationsintothefunctionofmiRNAs．ParttwooverexpressionofmiR-125bsuppressproliferationviatargetingEIF2C2BackgroundUncontrolledproliferationisoneofmajorcharacterinmalignancy．Deregulationofcellcircleleadstounregularproliferationintumorcells．ThesecondpartaimsatthatoverexpressionofmiR·125baffectsproliferationinHep一2celllineandmolecularmechanism．MethodToconstructHep．2一miR-125bcelllinewhichCanoverexpressmiR-125bstablyandHep．．2．．vectorblankcelllinewithlentiviralvector．TheproliferationofcellwasdetectedusingprolieferationWST-1kit，andcellcircleandapoptosiswascheckedwithflow气 复旦大学博士论文英文摘要cytometry．InvivoH印-2一miR-125bandH印一2-vectorcellswereinjectedintotwogroupofNOD／SCIDmouseseparatelyandcomparedtheirgrowth．DualluciferaseReporterassaytestedwhetherEIF2C2wasoneoftargetgenesofmiR-125b，andmRNAexpressionandproteinlevelweredetectedintwocelllines．Result．Hep·-2·-miR-125bcellcanexpresshighlevelmiR··125bstably．OverexpressionofmiR-125bcallsuppresstheproliferationofHep-2andthegrowthoftumorinNOD／SCIDmouse．ThecellcircleWasarrestedatGO—G1phaseandapoptosishadnodifferenceintwocelllines．miR-125btargetedEIF2C2viadualluciferasereporterassayandbothmRNAexpressionandproteinlevelwerealldecreasedinHep一2一miR-125bcellline．Conlusion．Up—regulationofmiR-125binHep-2celllinecouldsuppresstheproliferationinvitroandinvivothroughtargetingEIF2C2gene．miR-125bmaybeatargetingenetherapyofI，SCCinthefuture．Keyword：laryngealsquamouscellcarcinoma，microRNA，targetgene，proliferation，cellcircle，EIF2C2．ClassifieationCode：R739．656 复旦大学博士论文英文缩写miRNA／miRpri-miRNApre-miRNAncRNAsiRNALSCCHNSCCLCMqRT-PCRRr-PCROCTSAMFDRANT3’．UTREMTTGF-BEIF2C2GFPLip02000PBSHBSSFBSPINOD／SCIDTvTBLBTBSTBST英文缩写microI洲Aprimary-miRNAprecursor-miRNAnon-codingRNAsmallinterferenceRNALaryngealsquamouscellcarcinomaHeadandnecksquamouscellcarcinomaLasercapturemicrodissectionQuantitativerealtime—PCRReversetranscription—PCROmithineCarbamylTransferaseSignificanceanalysisofmicroarraysFalseDiscoveryRateadjacentnormaltissue3'-untranslationregionEpithelial--to·-mesenchymaltransitionTransitiongrowthfactor-13EukaryoticTranslationImtimionFactor2C，2GreenFluorescentProteinLipofectamine2000PhosPhatebuffersalineHank’SBalancedSaltSolutionFetalbovineserumPropidiumiodideNon．ObeseDiabetic／severecombinedimmunodeficiencydiseaseTumorvolumeTerrificbrothLuria-BertarlimediaTris．bufferedsalineTBS+Tween．201微小RNA原初微小RNA前体微小RNA非编码RNA小干扰RNA喉鳞状细胞癌头颈鳞状细胞癌激光捕获显微切割实时定量PCR逆转录PCR鸟氨酸氨基甲酰转移酶微阵列显著性分析假阳性率邻近正常组织3’．非翻译区上皮间质转化转化生长因子B真核转录起始因子2C，2绿色荧光蛋白脂质体2000磷酸盐缓冲液Hank’s平衡盐溶液胎牛血清碘化丙啶非肥胖糖尿病／重度联合免疫缺陷小鼠肿瘤体积浓汤培养基LB培养基嘣s缓冲液嘣s缓冲液+吐温 墨呈奎兰竖主笙壅一．．英文缩写——————————————————————————————————————————————————————————一一-：：：：：：：：SOBWBSPFSDS．PAGEIUSCAmpODNCDMSOSuperOptimalBrothWrestemblotSpecificPathogenFreeSodiumDodeeylSulPhate．-PolyacrylamidegelelectrophoresisRNA—inducedsilencingcomplexAmpicillinOpticaldensityNitrocellulosefiltermembraneDimethylsulfoxide2超级优化培养基蛋白免疫印迹实验无特定病原体十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳RNA诱导沉默复合体氨苄西林吸光度硝酸纤维素膜二甲基亚砜 复旦大学博士论文前言喉癌(carcinomaofthelarynx)是头颈部第二常见的恶性肿瘤[1】，据北美及欧洲流行病学研究显示其发病率为7．0／10万～16．2／10万人。我国部分省市的发病率为1．5／10万～3．4／10万人。1983～1992年问我国13个省市部分医院恶性肿瘤就诊患者中，喉癌占头颈肿瘤的13．9％，占全身恶性肿瘤的2．1％。喉癌男性较女性多见，为(7-10)：1，以40～60岁最多。喉部恶性肿瘤中96％98％为鳞状细胞癌，其他如腺癌、基底细胞癌、低分化癌、淋巴肉瘤和恶性淋巴瘤等较少见[2】。吸烟和饮酒是导致喉癌发生的两个主要危险因素，另一个危险因素是人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)，多见于不吸烟、不饮酒的喉癌患者，HPV感染相关的喉癌患者多见于年轻人，并且预后较好【3】。目前喉癌理想的治疗方式应该是多学科综合治疗，目的是提高患者生存质量、彻底切除病变减少复发和保留喉的发音与呼吸功能。喉部分切除术和经口激光手术很好的保留了喉功能，大大提高了患者的生存质量。分割放疗和调强适形放射治疗的应用使传统放疗的不良并发症大大减少，提高了局部病变控制率，为保留喉功能提供了新的选择[4】。各种新的化疗药物及靶向治疗的出现提高了放疗的敏感性，减轻化疗副作用，更有助于保留喉功能【5，6】。对于晚期喉癌和复发的喉癌，全喉切除仍是有效的治疗手段。喉癌和其他头颈鳞癌都被认为是经过多个阶段逐步发展形成的，从正常黏膜、增生肥厚、轻度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生、原位癌、侵袭性癌到转移。潜在的基因不稳定性包括某段染色体的杂合性缺失(10ssofheterozygocity,LOH)，某些癌基因或抑癌基因的上调或下调，包括表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)、P53、Rb、P56、环氧合酶2、P16、细胞周期蛋白D2和同源性磷酸酶张力蛋白(PTEN)已经在头颈鳞癌的不同病理阶段中被证实发生基因改变。其他一些基因以及它们相应的受体，包括E．钙粘蛋白、趋化因子受体／基质细胞衍生因子(CXCR4一SDFl)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子a和B(TGF．0【／B)、白介素．8以及基质金属蛋白酶都在肿瘤转移和肿瘤进展的早期发挥了重要作用[7]。微小RNA(microRNA，简称miRNA)是一种在动植物中广泛存在、序列上高度保守的小分子非蛋白编码RNA，含有大约22(18-24)个核苷酸[8]，一般通过与特定mRNA的37端非翻译区(37UTR)的特异结合，抑制靶基因mRNA的翻译或促使靶基因mRNA的降解，调节基因的表达[9]。已有的研究表明miRNAs在细胞的增殖分化、细胞的生存、细胞凋亡具有重要的调节作用，在疾病和健康的基因调节方面处于中心的角色。自1993年Lee[10]等在研究秀丽隐杆线虫发育缺陷时首次发现第一个miRNA以来，目前已经证实人类基因组中存在1500多种不同的miRNAs。 复旦大学博士论文图1miRNA的生物合成和生物学作用机制miRNAs是miRNA基因编码的产物，如图1所示，编码miRNA的基因先被RNA聚合酶II转录为较长的初始转录本，该转录本含有数千个核苷酸，称其为原初miRNA(pri．miRNA)，在pri．miRNA内，miRNA位于由大约70～90nt构成的茎环结构内[11]。这些茎环结构在细胞核内被RNA聚合酶IIIDrosha和辅助蛋白Pash棚GCR8组成的复合物(命名为microprocessor)识别和切割，形成前体miRNA(precursor-miRNA，简称pre．miRNA)[121，pre．miRNA迅速被Ran．GTP依赖的转运蛋白Exportin5转运至细胞质中[13】，被位于细胞质中的RNA聚合酶IIIDicer和辅助蛋白TRBP／AG02组成的复合物进一步切害lJ[14]，产生一个类似于小干扰RNA(siRNA)的miRNA--miRNA*双链复合体(miRNA*是miRNA的互补序列)，随后该双链体解旋为成熟的miRNA和miRNA*，成熟的miRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA．inducedsilencingcomplex，RISC)结合形成miRISC复合物与37UTR区结合。miRNA参与很多细胞生理过程，包括生长、分化、凋亡、增殖、应激反应、脂肪代谢和胰岛素分泌[15】。目前已知miRNA有两种作用方式：导致靶基因mRNA降解和抑制靶基因mRNA的翻译。前者在miRNA与mRNA完全互补的情况下发生，后者在不完全互补的情况下发生[161。一种miRNA可以调节多个靶基因，而一个靶基因可由多个miRNA调节，这表明miRNA和mRNA之间的相互作用是一个复杂的网络。在不同的时空发育阶段，miRNA的表达量不同。多种miRNA在同一个细胞中的表达使得细胞处于一种相对稳定的环境，这个环境控制着成千上万的编码基因的 复旦大学博士论文前言mRNA水平，使得各种蛋白的表达处在一个适合的水平。因此，miRNA是目前表观遗传学研究的一个新热点。在肿瘤的miRNA研究中，一方面miRNA可以被认为是抑癌基因，已有研究发现在恶性肿瘤组织中，某些miRNAs表达水平下调。另一方面，miRNA也被视作癌基因，在恶性肿瘤组织中经常发现某些miRNAs表达水平上调[17，18】。miRNA是目前表观遗传学研究的热点之一，基于miRNA在疾病和生命过程中的发挥的调节作用，我们希望探求miRNA在喉癌的发生、进展、转移以及复发中的作用，了解miRNA在喉癌中发挥作用的分子机制。通过应用激光捕获显微切割(1asercapturemicrodissection，LCM)技术获得同源的喉癌组织细胞，采用miRNA微阵列芯片检测喉鳞癌及癌旁正常组织，获得miRNA异常表达谱，应用实时定量PCR(quantitativerealtime．PCR，qRT-PCR)法进一步验证喉鳞癌组织中表达显著差异的miRNAs，通过在线生物信息学软件，我们预测出差异表达miRNAs可能调节的靶基因，结合头颈鳞癌表达异常的基因，在喉癌组织及癌旁正常组织中应用qRT-PCR法验证了表达差异的靶基因。在miRNA的功能研究中，我们选择低表达的miR-125b进一步研究。在Hep．2喉癌细胞系中，我们通过慢病毒感染上调miR-125b表达水平，在体外及体内实验中观察其上调后对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响，并通过双荧光素酶报告基因检测系统验证其调节的靶基因，最后通过蛋白水平检测进一步验证。9 复旦大学博士论文前言参考文献【1】E．A．Chu,Y．J．Kim．Laryngealcancer：diagnosisandpreoperativework—up[J]．OtolaryngolClinNorthAm，2008，41(4)：673-695【2】周梁，董频．临床耳鼻咽喉头颈肿瘤学【M】．上海：复旦大学出版社，2008：220【3】J．L．Baumann，S．Cohen，A．N．Evjeneta1．Humanpapillomavirusinearlylaryngealcarcinoma[J]．Laryngoscope，2009，119(8)：1531—1537【4】A．A．Forastiere，H．Goepfert，M．Maoreta1．Concurrentchemotherapyandradiotherapyfororganpreservationinadvancedlaryngealcancer[J]．NEnglJMed，2003，349(22)：2091．2098【5】J．A．Bonner,P．M．Harari，J．Giralteta1．Radiotherapypluscetuximabforsquamous．cellcarcinomaoftheheadandneck[J]．NEnglJMed，2006，354(6)：567-578【6】M．R．Posner,D．M．Hershock,C．R．Blajmaneta1．Cisplatinandfluorouracilaloneorwithdocetaxelinheadandneckcancer[J]．NEnglJMed，2007，357(17)：1705—1715【7】R．I．Haddad,D．M．Shin．Recentadvancesinheadandneckcancer[J]．NEnglJMed,2008。359(11)：1143．1154【8】V．Ambros．ThefunctionsofanimalmicroRNAs[J]．Nature，2004，431(7006)：350．355【9】J．Liu，M．A．Valencia—Sanchez，G．J．Hannoneta1．MicroRNA．dependentlocalizationoftargetedmRNAstomammalianP-bodies[J]．NatCellBiol，2005．7(7)：719．723【10】R．C．Lee，＆L．Feinbaum，V．Ambros．TheC．elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14[J]．Cell，1993，75(5)：843-854【11】U．Ohler,S．Yekta,L．P．Limeta1．Patternsofflankingsequenceconservationandacharacteristicups仃eammotifformicroRNAgeneidentification[J]．RNA，2004，10(9)：1309-1322【12】J．Han，Y．Lee，K．H．Yeometa1．MolecularbasisfortherecognitionofprimarymicroRNAsbytheDrosha-DGCR8complex[J]．Cell，2006，125(5)：887—901【l3】R．Yi，Y．Qin，I．G．Macaraeta1．Exportin-5mediatesthenuclearexportofpre-microRNAsandshortha卸inRNAs[J]．GenesDev，2003，17(24)：3011-3016【14】T．P．Chendrimada,&I．Gregory,E．Kumaraswamyeta1．TRBPrecruitstheDicercomplextoA902formicroRNAprocessingandgenesilencing[J]．Nature，2005，436(7051)：740-744[15】V．Ambros．ThefunctionsofanimalmicroRNAs[J]．Nature，2004，43l(7006)：350-355【16】D．P．Bartel．MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，andfunction[J]．Cell，2004，116(2)：281．297【17】P．S．Meltzer．Cancergenomics：smallRNAswithbigimpacts[J]．Nature，2005，435(7043)：745-746【18】A．Esquela-Kerscher，F．J．Slack．Oncomks-microRNAswitharoleincancer[J]．NatRevCancer，2006，6(4)：259．26910 复旦大学博士论文第一章第一章喉鳞癌组织microRNA表达谱变化及候选靶基因分析研究背景微小RNA(microRNA，miRNA)是一类非编码RNA(ncRNA)分子，它们大小在18~24个核苷酸，在人类基因组中miRNA首先被RNA聚合酶II转录为pri．miRNA，miRNA位于由大约70～90个核苷酸构成的茎环结构内。pri．miRNA在细胞核内被Drosha和辅助蛋白Pasha／DGCR8组成的复合物识别和切割，形成pre．miRNA，pre．miRNA被转运蛋白Exportin5转运至细胞质中，被位于细胞质中的Dicer和辅助蛋白TRBP／AG02组成的复合物进一步切割，产生出类似于小干扰RNA的miRNA--miRNA*双链复合体，随后该双链体解旋释放出成熟的miRNA，通过结合靶基因mRNA的3'-UTR区种子序列，在基因表达的转录后水平发挥调节作用[1]。miRNA和靶基因mRNA的互补程度决定靶基因沉默的机制：接近完全互补导致靶基因mRNA降解，不完全互补导致翻译过程抑制【2】。miRNA参与很多细胞生理过程，包括生长、分化、凋亡、增殖、应激反应、脂肪代谢和胰岛素分泌[3]。在恶性肿瘤中，那些表达水平上调的miRNAs通常被认为发挥癌基因的作用，而那些表达水平下降的miRNAs被认为是抑癌基因。当前，在很多恶性肿瘤中已经发现miRNA发挥不同的调节作用，其中也包括头颈部鳞癌【4，5，6，7】。喉癌(carcinomaofthelarynx)是头颈部第二常见的恶性肿瘤[8】，尽管头颈部鳞癌(headandnecksquamouscellcarcinoma,HNSCC)经常作为一个整体进行研究，但是美国癌症协会认为喉是与口腔和咽部不同的，它应该归为呼吸系统的一部分[9】。而且，喉癌的发病率和男女性别比例显然要比其他头颈鳞癌更高[9]。在不同亚型的头颈鳞癌中，通过比较基因组杂交技术已经发现不同类型的染色体畸变[10】。因此，为了避免头颈部鳞癌作为整体研究的偏倚，我们认为有必要分别认识各种亚型头颈鳞癌的不同特性，对每个解剖部位的恶性肿瘤分别研究是更理想的选择。在本研究中，为了避免肿瘤组织中大量间质细胞的影响，通过采用激光捕获显微切割(1asercapturemicrodissection，LCM)技术获得同源的喉癌组织细胞。采用miRNA微阵列芯片技术比较6对喉鳞癌组织和相对应癌旁正常组织的miRNA表达谱，目的是发现喉癌组织中表达差异的miRNAs。通过实时定量PCR(quantitativerealtime．PCR，qRT-PCR)验证miRNA芯片结果，证实6个差异表达的miRNAs，包括上调的miR-21、miR．93、miR．205和miR．708，以及下调的miR．125b和miR．145，其中miR．708和miR-145是在喉癌中新发现的miRNA分子。通过生物信息学软件预测并结合头颈鳞癌表达异常的基因，在喉癌组织及癌旁正常组织中应用qRT-PCR法验证候选靶基因。 复旦大学博士论文第一章材料与方法1样本信息及样本保存本项研究经过复旦大学附属眼耳鼻喉科医院伦理委员会批准，所有患者均签署手术知情同意书。所有的组织样本收集自2010年3月至2010年8月间，就诊于复旦大学附属眼耳鼻喉科医院、病理证实为喉鳞癌的患者。所有患者在手术前均未经历放疗和化疗。54对喉鳞癌组织和相对应癌旁正常黏膜组织均采集白喉癌患者初次手术切除的外科标本。肿瘤组织和癌旁正常组织按以下标准采集：①肿瘤组织取自标本的中央部分，去除表面坏死组织和粘液，在肿瘤组织中肿瘤细胞的比例至少达到80％；②癌旁正常组织取自手术切缘的边缘黏膜，去除黏膜下层组织只保留鳞状上皮。如果在术后病理中发现手术切缘可见肿瘤细胞残留，此对样本组织将被排除本项研究。每份肿瘤组织样本被分为两部分：一部分采用鸟氨酸氨基甲酰转移酶(omithinecarbamyltransferase，OCT)包埋后储存在．80。C，另一部分肿瘤组织及癌旁正常黏膜分别浸入RNAlater溶液，室温下放置24小时后储存于．80℃。喉癌患者的TNM分期采用2002年美国癌症联盟一国际抗癌联盟TNM分期标准。表1．154例喉鳞癌患者临床病理资料。characteristicscasesI-IIⅢ．ⅣprimarytumorpTI-pT2pT3-pW4lymphnodemetastasisNoNI-N4sitesupraglotticglottichistologySCCI．IISCCIISCCII．III3321513铋．此晦酊酪北|萋e讪蛳溺懿砌艋姆9513409565凹巧钉筋钳m挎弱M弱3 复旦大学博士论文第一章2实验材料及试剂组织冰冻包埋剂：德国徕卡公司鸟氨酸氨基甲酰转移酶(OCT)；RNAlater：Invitrogen公司：TRIzolReagent：Invitrogen公司；氯仿、异丙醇、无水酒精等化学试剂均为国产分析纯；RiboLockTMRNaseinhibitor：Fermentas公司；E．coliPoly(A)．NEB公司；M．MLV反转录酶：Promega公司；实时定量PCR预混液：BIO．RAD公司iTaqTMSYBR＆GreenSupermixWithROX；普通PCR预混液：杭州莱枫公司2xTaqPCRMasterMix；PrimeScript⑩RTreagentKitPerfectRealTime·TaKaRa公司384孔实时定量PCR板：ABI公司dNTP(10mM)：上海申能博彩生物科技有限公司；DNA分子量标准MarkerI(100bp-600bp)、MarkerlII(200bp-4500bp)：天根公司；RNAasefree的实验耗材：Axygen公司；PENMembraneFrameSlides：德国MDSAnalyticalTechnologiesCaptureMacroLCMCaps：德国MDSAnalyticalTechnologies3实验仪器VeritasTMMicrodissectionInstrument全自动激光捕获显微切割仪：美国ArcturusBioscience公司；冰冻切片机：德国SLEE公司；普通PCR仪：Eppendorf公司Eppendorfepgradientsthermalcycler；实时定量PCR仪：ABI公司ABI一7900；凝胶成像系统：复日科技FR．200A全自动紫外与可见光分析装置；ND．1000Nanodrop：Thermo公司4．实验方法4．1激光捕获显微切割(LCM)：采用6份肿瘤组织样本进行LCM，患者均为男性，平均年龄57～71岁，TNM分期为3例T2NoMo、1例T3NoMo和2例T3N2Mo，采集到的肿瘤细胞用于miRNA芯片检测；(1)将包埋在OCT中的肿瘤组织样本切割成8um厚度的冰冻切片，然后转移至PENMembraneFrameSlides玻片上；1气 复旦大学博士论文第一章(2)切片经无水乙醇固定，HE染色，并序贯经过梯度乙醇脱水；(3)经二甲苯透明后在空气中挥发晾干；(4)将玻片置入激光显微切割仪内，运行电脑程序，采集肿瘤细胞至CaptureMacroLCMCaps上，直至Cap上铺满细胞(大约1x105个细胞)；(5)将捕获的肿瘤细胞转移至RNAasefree的1．5mlEP管内，立刻加入lmlTrizol抽提RNA。4．2TRIzol法提取组织总RNA：(1)将冻存在RNAlater内的样本至于冰浴中解冻，取出米粒大小的组织于灭菌好的铝箔纸中包好，液氮冷冻后敲碎(锤子要用灭菌的铝箔纸包好)：(2)将处理好的组织转移到匀浆器中，加入lmlTRIzol溶剂(尽量将组织全部转移到匀浆器)充分匀浆至不见颗粒状物质；(3)将充分匀浆好的组织液转移至编号的EP管中，加入200ul氯仿(约l／5体积TRIz01)，剧烈振荡后，冰上放置5min，12000rpm40C离心15min；(4)轻轻取出EP管，小心吸取上清液转移到新的EP管中，约400—600ul，注意不要吸到第一液相以下任何物质，可以轻微倾斜；(5)加入异丙醇500ul(与步骤4等体积)，来回颠倒后置于．20℃1．2h或．80。C30min，使RNA充分沉淀，12000rpm0C离心7．10min后，倒掉上清液；(6)加入75％的乙醇(DEPC水配$1J)lml，洗涤后12000rpm0C离心3-5min，此步可以重复一次；(7)轻倒出上清液，在灭菌的纸上轻叩，然后稍离心，6000rpm40c3min：(8)小心吸出剩余液体(10ul小枪，间隔时间尽可能短，减少RNA溶解)；(9)加入60ul的DEPC水溶解，可以560C助溶；(10)测OD260／280nm值。4．3microRNA微阵列芯片检测：本次实验采用博奥公司AffymetrixRGeneChipmiRNAArray芯片，该芯片包含46228个探针，来源于SangermiRBasemiRNAdatabasevl1数据库。芯片检测按Affymetrix操作指南进行，微阵列显著性分析(Significanceanalysisofmicroarrays，SAM)用于确定肿瘤组织和癌旁正常组织之间的miRNA差异表达，如果至少3个样本中假阳性率(falsediscoveryrate，FDR)q值茎5并且差异倍数(foldchange)>2或<0．5，该miRNA被认为有显著差异。4．4总RNA加poly(A)尾反转录 复旦大学博士论文第一章4．4．1总RNA加poly(A)反应：反应体系如下：总RNA10xbufferrATP(100mM)RNAaseinhibitorPolyA聚合酶DEPC去离子水2000ng0．5gl1．0“l0．5“l0．5gl补足到15pl混匀后与PCR仪上：370C反应20min，40Choldon，置于冰上5min。4．4．2总RNA反转录：(1)紧接上一步加poly(A)尾反应后，在原管中加入2glmiRdTRT反转录引物(浓度为1btg／-t1)；(2)混匀后于PCR仪上700C反应5min后，40Choldon，然后放置冰上2分钟；(3)反转录反应体系，向原管内再依次加入：5×M-MLVbuffer20gldNTP(10mM)lulM．MLV反转录酶1．5LllRNAaseinhibitor0．5glDEPC去离子水77H1(4)轻轻混匀后，于PCR仪上：300C，15min：370C，15min；420C，30min：80。C，5mira40Choldon。4．5普通PCR方法检测miRNA引物特异性：反应体系20}tl如下：总RNA反转录模板(一般将反转录产物稀释10倍)1肛1通用反向引物miR．Hi．Rev1ulmiRNA特异的正向引物1LLl2xTaqbuffer10“l去离子水7LLl15 复旦大学博士论文第一章反应程序如下：1cycle5cylces18~25cylces木Holdon奉具体循环次数要看相应miRNA的表达量，一般为19个循环。表1．2miRNAs检测引物序列表。miRNA引物序列hsa．．miR．．221hsa-miR．222hsaomiR．31hsa-miR-205hsa-miR-l55hsaomiR．663hsa-miR．．455．．3phsa-miR-18lbhsa-miR．708hsa．．miR．．93hsa-miR．1207．5phsa．．miR．．1307hsa-miR．1228"hsa-miR．193bhsa-miR．21hsa-miR-22hsa-miR．23ahsa．miR-18ahsa-miR-185hsa．．miR．．25hsaomiR-106bhsa．miR-15bhsaomiR．130bhsa-miR018lahsa．miR．16hsa．．miR．．140．．3phsa．．miR．．125bhsa-miR．14518spoly(A)forwardmiR-Hi—ReVprimermiR-dTRTprimertgggtagctacattgtctgctgggttactgagctacatctggctactgtagctaggcaagatgctggcatagctgtctgtccttcattccaccggagtctggatagttaatgctaatcgtgataggggtaccgcaggcggggcgccgcgggaccgctacacgcagtccatgggcatatacaccggtgaacattcattgctgtcggtgagctgaaggagcttacaatctagctgggtagcaaagtgctgttcgtgcaggtagggaggtggcagggaggctgggaggggtcgtgactcggcgtggcgtcggtcgtg酉百g垂gggcgggggcag班酵舀gccgctaactggccctcaaagtcccgctgttgatagcttatcagactgatgttgaactgtaagctgccagttgaagaactgtatttcatcacattgccagggatttcgatagtaaggtgcatctagtgcagatagcctgatggagagaaaggcagttcctgatctgacaagcacRgtctcggtctgacagattaaagtgctgacagtgcagatttacatagcagcacatcatggtttacaggcatcagtgcaatgatgaaagggcattgagtaacaRcaacgctgtcggtgagttggcgtagcagcacgtaaatattggcgcacggtaccacagggtagaaccacggtgtgatccctgagaccctaacttgtgagaatcgtccagttttcccaggaatcagtcgtaacaaggtttccgtaggtgccagtctcagggtccgaggtattccgactcgatccagtctcagggtccgag。一gtattcgatcgagtcgcaciiiiiiiiiiiiv16 复旦大学博士论文第一章4．6普通反转录：按PrimeScript⑩RTreagentKitPerfectRealTime说明书操作：反应液配制在冰上进行，总反应体系为lOI．tl：总I矾A500ng5xPfimeScript⑧Buffer2山(forRealTime)PrimeScript⑩RTEnzyme0．5rtlMixIOligodTPrimerRandom6mers0．5lxl0．5rtlRNaseFreedH20补足到10rtl混匀后与PCR仪上：370C15min，85。C5sec，40Choldon，反应后将cDNA模板稀释10倍后备用；4．7普通PCR方法检测mRNA引物特异性：反应体积20}tl，体系组成如下：cDNA模板反向引物正向引物2xTaqbuffer1肛l1lxl10肛1表1．3候选基因mRNA引物序列表。GenesymbolSequenceofprimerI也LSERPINESTClXBPlNFKBIEAPPBP2TNFAIP3RAB6BVACM．1ALDH9A1F-ttacaacaatgccgatgac，R-atgctcagaagtcttggatF—ggtgaatgccctctactt，R-gttgaacttgttggtctgaF-aaggatgattgctgaggt，R-ctgttggagaagtgattggF—ggattctggcggtaRga，R-gaggctggtaaggaactgF-tctggcattgagtctctg，R-cttctcctgtggttccttF-agttgtggtggatgtctta,R-ccataatctagcagtgtatcagF-gttcctcctctcctacca，R-cgatgaagcagtcctgatF-tccttgcRgttgtgttg，R-gccgttaagagtgatgtgF-gtatgccagcggattatg，R-ttcagtaggaagtgagacaaF-agtgttat酉ggtggagm，R-agtggtatcattggctctt17 墨呈奎兰堡主笙茎．．第一章——————————————————————————————————————————————————一．．：：：．=——A—N——X——A——1——————————————F—-—g—a—a—t—g—a—a—g—a—c—t—t—g—g—c—t—g—a—t—t—,—R—-—t—g—c—t—ta—c—t—g—ta—c—ttggtgtaBPGMF-agatgtattgctgtccttga,R-attccttcgctgttgagtCSTBF-caagaagttccctgtgttt，R-ttgttggtctggtagttagaHS3ST1F-aacgaggtccacttcttc，R-gggttcatgctgtagactMGLLF-catccaactgctgaatgc，R-atcttgagagtcttgtcctgTRPS1F-ctggatgaagtgatgtatgc，R-aattgtgctaagtgctaaggWASF3F-tgtcttccaaccagtaagt，R—agcagagcatcagattcaCEACAM6F-cctggtgtagtgtattctct，R-ggttatgatgttctcctgatgDVL3F-atcatcacggtcactctc，R-cctgtaacaacatatctcctgCCNG2F-ccatctgtattagccttgtg，R-agtagaagaactcagtgtcaITGAXF-tgccacgatgatgaactt，R-gtgaacagaagccaacagDUSP6F-gactgtggcttaccttat，R-ccatgaagttgaagttaggEIF2C2F-acaagaacgagcgggttg，R-tggatgccagcgtgactaYES1F-tcctgctggtttaacaggtggtg，R-tgcttcccaccaatctccttccOSRl一F-ccaagaccaa—gaaggaat,R-cgctcatggat—aagtagg—J3-actinF-tgacgtggacatccgcaa—a—g—,R——-—c—tg——g—aa—g——g—tg—g—a—c—a—g—c—g——a—g—g—————————反应程序如下：—————————————————————————————————-——————————一_94．00C3min940C30sec720C5min40c600C30sec720C30sec————————————————————————————————————————————————————一卫!皇35cylces1cycleHoldon————————————————————————————————————————————一4．8实时定量PCR(1)实时定量PCR反应体系：总反应体积为10lal：2xiTaqSYBRGreenSupermixWithROX5ulmiRNAForward(10pmol／I．tL)O．5ulmiR-Hi-Rev(10pmol／此)0．5ul加poly(A)尾反转录cDNA模板(稀释10倍)1u1．去离子水3ul2xiTaqSYBRGreenSupermixWithROX5lxlmRNAForward(10pmol／IxL)0．51．tlmRNAReverse(10pmol／1．tL)0．5u1eDNA模板(稀释10倍)1LLl一圭离子水3u1--$．--18 复旦大学博士论文第一章(2)以18SrRNA作为内参基因分析miRNA[11，12】，以13-actin作为内参基因分析mRNA，Realtime．PCR反应条件如下：4．9靶基因生物信息学预测：3个在线生物信息学软件用来预测miRNA的靶基因：TargetScan(http：／／www．targetscan．org／index．html)，PicTar(http：／／pictar．bio．nyu．edu／)，和miRanda(http：／／www．microma．org／microma／home．do)。每个miRNA的候选靶基因至少被两个软件同时预测。5统计学分析：所有的结果均采用SPSSl3．0统计分析。芯片结果采用两组配对t检验分析。qRT-PCR结果采用SDS2．3软件分析，将各样本Ct值代入公式：相对基因表达量22-t溘ct[13]，其中AACt=(目的miRNA的平均Ct值．18S的平均Ct值)，肿瘤组织组和癌旁正常组织组数据采用配对t检验分析，p<0．05有显著性差异。19 复口．人学博。l：论文第一章实验结果1．喉鳞癌组织中miRNA芯片表达谱采用LCM技术获得6例喉鳞癌组织肿瘤细胞，图1．1是LCM操作过程中捕获细胞采集的图像。A．1A．220 复口．人学博l：论义第一章A．3漂黼2l懋嚣一蕊袋簿≮ 复旦大学博士论文第一章B．2B一3图1．1通过LCM软件采集的图像。A和B分别来自两例喉鳞癌肿瘤组织。A．1和B．1是显微切割之前的图像，其中A．1己经勾画出肿瘤细胞与间质细胞的边界，最后将沿绿线进行显微切割。A．2和B．2是显微切割之后的图像，肿瘤细胞已经从slide上转移至收集细胞的cap上。A．3和B．3是cap上收集的细胞图像，直至将cap铺满。6例LCM采集的喉癌肿瘤细胞和相应的癌旁正常组织抽提总RNA后进行AffymetrixGeneChipmiRNAArray芯片检测，根据检测样本≥3，q-value(％)_<5，差异倍数>2或<0．5，miRNA芯片共筛选出66个差异表达的基因，见图1．2。本研究只讨论miRNAs，将其余的基因排除。通过配对t检验分析miRNA芯片的结果，设定p-value 4)，只有3个miRNAs表达下调。hsa-mlR-320asths争le}7ls1hsa-miR·423·3Dsthsa-miR·155sthsa-miR·181bsthsa．miR·193bslU17bsIgi555853一copse—stgi555853．．colWo．．st91555853一copyl一sta155j85j—copy3一eta1555853一copy6一st91555853一c01玎4—8I91555853一c01珂2一sl91555853cO口vgStgt555853_copy7一st8慧蔫絮t53∥‰6’U17bxstU43_stU43xsth9a-miR-663s1he}mIR．1207．5psthsavmilR·455·3psllhsa-miR·21slIhsa-miIR．106bstlhsa-miR一205一s1lh88．m1R-708stlhsa|rniR·2591lU783stIU78x$llIJ‘g^xst|I"188-m{R--307一slJ_18a-mlR．-50一slllJ66stI^C^18x3IIIU30sthsa-miR．1hsaJmiR-1hsa．m1R．1hea-mIR-1hsa-mlIR．1hs8-miR-112．50．67．8300B36750图1．2AffymetrixGeneChipmiRNAArray芯片筛查出的66个差异表达基因聚类图。黄色代表表达量上升，蓝色代表表达量下降。T和C分别代表肿瘤样本和癌旁正常黏膜样本。23S—rb科科甜引甜甜科噶砒"∞曲"蚰加啦”n0200卅五一．．7R开RRRRRR啡_芒州叫洲删㈨洲州}和}}}}}}扣峙j竺j窒№咻№惦№№ 复_口^人学博士论文第一章＆：=吊g导：＆2吊g零卜I卜_卜_卜．卜-卜oosa—miR一31stsa·miR-155slsa．miR．181bSlsa—miR．19313stsa-miR一1228．starsⅢsa—miR一1826Slsa—miR．663Slsa—miR·1207—50Slsa·miR一221slsa—miR一222slsa—miR-93stsa-miR-23aslSa—miR．22stsa·miR一205Slsa-miR-708slsa．miR-25st5a·miR一1307slsa-miR-15bslsa-miR-455．3pslsa·miR-21slsa—miR-106bslsa—miR．18aslsa-miR-185sIsa-miR-13013stsa-miR-181aStsa．milR．16Slsa．miR-140—30slsa—miR-125bsiEa-rniR．145Sl50678300．83．6750图1．329个差异表达miPNAs聚类分析图。其中红色代表表达量上升，绿色代表表达量下降。T和C分别代表肿瘤样本和癌旁正常黏膜样本。表1．429个差异表达miRNAs及染色体定位。hsa．miR．22lhsa-miR-222hsa—miR-31hsa．．miR．．2015hsa．miR．155hsa．miR．6636．?496．015615．95695．62155．0244．2073240．828151．48155900．02070．00870．024150．01080．01140．0333Xp11．3XplI．39p21．31q32．221q21．320p11．1Zrn叭加一乏 复旦大学博士论文第一章hsa．miR．1826hsa·-miR-455··3phsa．miR．181bhsa-mm708hsa．miR-1228．starhsa．miR．93hsa．m僻18lahsa-miR．193bhsa．m融2lhsa．miR．22hsa．miR-23ahsa．mil018ahsa．mml85hsa．miR．25hsa·-miR-1207··5phsa-miR-16hsa-miR-106bhsaomiR．1307hsa．miR．15bhsa．miR．130bhsa-miR-140-3phsa．miR-125bhsa．miR．1453．90193．81463．50073．43033．36233．27123．25542．96542．83512．63692．59142．49142．338l2．32．26092．21822．20262．1972．16432．097l0．49060．38890．34350．4660．828500．46600．82850．466O1．48590．4661．48590．95820．000l0．00340．00260．00640．01880．00520．01680．01070．03l0．00530．00480．0ll0．02450．00170．00350．03820．01840．00050．03440．01010．00130．00040．0203chrl6p9q32lq32．11lql4．1chr127q22．1lq32．116p13．1217q23．117p13．319p13．1313q31．322ql1．217q22．1chr816p12-pl1．27q22．1chr103q25．33chr2216q22lq24．15q322．实时定量．PCR验证miRNAs共抽提54对喉鳞癌组织和相对应癌旁正常黏膜组织的总RNA，分别进行加poly(A)尾反转录和普通反转录，用普通PCR方法检测内参基因18SrRNA评价模板质量，对于不合格模板重复反转录并检测直至合格，见图1．4。根据miRNA序列我们设计了特异的上游引物，并用普通PCR方法检测引物是否存在引物二聚体，部分结果见图1．5。对引物二聚体严重的miRNA引物我们重新设计上游引物，直至检测合格。在48对LSCC样本和相对应癌旁正常黏膜样本中，使用特异的miRNA上游引物和通用的下游引物对29个候选miRNAs进行qRT-PCR(SYBRGreen法)验证。对检测结果采用2以△C‘方法运算并进行配对t检验，结果显示有6个miRNAs在LSCC样本和相应癌旁正常黏膜样本中表达差异，其中上调的miRNA有4个，分别为：miR-21、miR．205，、miR．93和miR-708；下调的miRNA有2个，为：miR．125b和miR．145，结果见图1．6。部分qRT-PCR(SYBRGreen法)结果的扩增曲线和溶解曲线如图1．7。25 图1．4部分加poly(A)尾反转录模板检测图1．5部分miRNA引物检测26 图1．66个差异表达miRNAs的散点图。缩写：癌旁正常组织(adjacentnormaltissue，简称ANT)。瓣一一120"Q—hM∞，T●roH■mH’口H钿h-瞻‰∞x●p，je口图1．7ABI．7900检测miRNA表达的部分扩增曲线、溶解曲线。27 复旦大学博士论文第一章3．生物信息学预测mLRNA调节的靶基因根据成熟miRNA和靶基因mRNA3'-UTR区种子序列结合的互补原则，我们采用3个在线生物信息学软件预测6个miRNAs可能调节的靶基因。为了提高预测准确性，每个入选的靶基因至少在2个软件中被预测，有些基因甚至在3个软件中都可以预测出。将软件预测的候选靶基因与已发表的LSCC和HNSCC基因表达相比较[14，15，16，17】，我们发现25个候选靶基因，包括14个表达上调的基因(受miR．125b和miR．145调节)和11个表达下调的基因(受miR．21、miR．205、miR．93和miR-708调节)。6个miRNAs和候选靶基因见表1．5。表1．5差异表达miRNAs的候选靶基因。 复旦大学博士论文第一章4．实时定量PCR验证靶基因表达水平对普通反转录获得的cDNA模板，用普通PCR方法检测内参13-actin以评价模板质量，对于不合格模板重复反转录并检测直至合格，见图1．8。针对25个候选基因，采用引物设计软件分别设计qRT-PCR引物，应用普通PCR检测是否存在目的条带或引物二聚体，见图1．9。若引物不合格重新设计检测直至可以上机检测。在24对LSCC样本和相应癌旁正常黏膜样本中，采用qRT-PCR(SYBRGreen法)检测25个候选基因的mRNA表达水平。对检测结果采用2‘△△C‘方法运算并进行配对t检验，以p<0．05差异有统计学意义，结果显示在LSCC组织中，2个基因．SERPINE和EIF2C2的mRNA表达量升高，8个基因，包括ALDH9A1、ANXAl、CCNG2、CEACAM、HS3STl、CSTB、MGLL和TRPSl，mRNA表达量降低，结果见图1．10。部分qRT-PCR(SYBRGreen法)结果的扩增曲线和溶解曲线如图1．11。图1．8部分cDNA模板质量检测29 CEACAM”P<0．00011．0一。掳0．8-●o△瑟0．6。o_-言0．4．■■■日，·～用}0．2一_二■●U■一o····盎_-o一-·⋯‘■U·u—T一一矿辜30一如惦伸惦∞一O0O，一co一研价o-I△×∞m>；∞-I币△L_cou— 复旦大学博士论文第一章图对表达水平。缩写：癌旁正常组织(adjacentnormaltissue，简称ANT)。表1．6喉癌组织中mRNA表达有差异的候选靶基因与miRNAs3l 复旦大学博士论文第一章∞O¨m一口O，，4∞m¨0"Ⅲ“T_T●H●¨cft，渊ed川’P哺妇帆’：9∞b‘∞。j#日3二图1．11ABI-7900检测mRNA表达的部分扩增曲线、溶解曲线。 复旦大学博士论文第一章讨论本项研究第一次采用LCM技术获得同质的喉癌组织细胞，并在成对的LSCC样本和对应的癌旁正常黏膜样本中检测miRNA差异表达。肿瘤组织是由多种细胞类型组成的不均质混合物，这些细胞具有不同的形态和功能，例如癌细胞和间质细胞。LCM技术提供了一种快速、可靠的方法从不均质的肿瘤组织标本中分离出同质的肿瘤细胞群(homogeneouscells)，因此，研究者可以在单纯的细胞群中准确地分析DNA、RNA和蛋白质[18]。即使肿瘤细胞团在切片上呈不规则形，LCM仪器仍然可以识别并获得这些细胞。将LCM作为一项标准方法来获得同质细胞是相当有价值的，特别是在小样本筛查研究中。尽管在筛查研究中LCM有其自身的优势，这些源于LCM得到的结果仍然无法替代扩大样本进行验证。在本项研究中，尽管miRNA芯片结果显示有29个miRNAs表达有差异，但经过扩大样本qRT-PCR(SYBRGreen法)验证，只有6个miRNAs被证实有意义，这与肿瘤患者的个体差异有密切关系。与在头颈鳞癌中miRNA表达趋势一致[19，20，21]，表达上调的miRNAs多于下调的miRNAs，而且，在LSCC中最终差异表达的miRNAs要少于HNSCC中的数量。miR-21、miR．205，、miR．93和miR．125b在喉癌中的表达趋势与在头颈鳞癌中是一致的[19，20，21]，上调的miR-708和下调的miR．145是在喉癌中新发现的miRNAs。基于头颈鳞癌的miRNA表达谱，已经有人研究miRNA在喉癌中发挥的功能【22，23，24，25，26]，包括miR-21、miR．16、miR．34c和let．7a，尤其是miR．21在肿瘤发展过程中担当的角色已经在很多类型的肿瘤中被广泛研究，目前miR．21已经被公认为是一个关键的致癌因子[27]。在本研究中，miR-21表达上调与已有的研究是一致的，miR．21在肿瘤发展过程中发挥的调节作用应该被进一步详细研究。在本研究中，miR．34c和let．7a在LSCC中表达没有差异，miR-16在miRNA芯片结果中显示表达上调，但在扩大样本验证后并没有被证实。一方面，这是由于HNSCC的miRNA表达谱并不能替代头颈部解剖部位特异的肿瘤miRNA表达谱，另一方面，miRNA的表达可能受肿瘤样本异质性和患者年龄的影响[28]，也就是说，miRNA的表达具有“时空特异性”。关于miR．205的表达存在一些矛盾现象。已有研究显示miR．205在HNSCC细胞系[6]和小鼠转移鳞癌中高表达[29]，在本研究中，我们证实miR一205在喉癌组织中比在癌旁正常组织中表达高。而Kimuraetal报道miR-205在头颈鳞癌和正常鳞状上皮中均高表达[30]，这种调节异常同样也在乳腺癌中发现【31】。然而，也有报道miR．205低表达是头颈鳞癌的预后标志物[32]。这些发现提示不能忽视肿瘤样本异质性的影响，也说明miRNA和肿瘤之间关系的复杂性。因此，miR．205不能简单的被视作癌基因或抑癌基因，它在喉癌中发挥的作用值得进一步研究。一致的结论是miR-205和miR．200 复旦大学博士论文第一章家族与非小细胞肺癌、乳腺癌和头颈梭形细胞癌中发生的上皮细胞间质转化(EMT)有关[33，34，35]。除了某些具有被广泛接受功能的miRNAs外，例如miR．21，目前很难判定某一miRNA在肿瘤发生、侵袭、转移和复发中发挥确切的作用。同一个miRNA可能在一种肿瘤中上调，而在另一种肿瘤中下调。总之，miRNAs可以作为癌基因或抑癌基因发挥双重作用，一旦这种平衡被打破就可能导致肿瘤发生或演进。已有报道miR-708在结肠癌、膀胱上皮细胞癌、肺癌和白血病中高表达[36，37，38，39]，这是首次在喉癌中发现高表达。然而，在肾癌中miR．708低表达，并且恢复其表达后可以抑制肿瘤细胞生长、克隆形成、侵袭和迁移及诱导凋-i=[401。miR-708在肿瘤发展过程中的作用仍然不清楚，其调节的靶基因在现有文献中没有提及。miR．93是miR．106b．25簇的一员，在乳腺癌和肝癌中表达上调[41，42]，由于这些家族成员具有相似的种子序列，miR-106b．25簇上调会共同发挥致癌功能[42]。而且miR-93和其他家族成员可能通过靶向TGF．p受体II来促进诱导多能干细胞生成『431。研究miR．93及其家族成员在喉癌中发挥的作用会是有意义的。在喉癌中表达下调的miR-125b和miR0145，在其他肿瘤中也被认为是抑癌基因。已经发现在肝癌和肺腺癌中上调miR-125b和miR．145会抑制肿瘤细胞增殖【44，451。miR-145表达下调是首次在喉癌中被发现，而且没有报道miR．125b和miR-145在头颈鳞癌中发挥的作用。一般来说，miRNA通过结合靶基因mRNA3'-UTR区的种子序列诱导mRNA降解或抑制翻译过程[2】。根据碱基配对原则，很容易通过生物信息学软件预测miRNA调节的靶基因，理论上一个miRNA可以调节很多靶基因。由于采用不同的运算法则，不同软件预测出来的靶基因是大不相同的，找到那些被不同软件共同预测出来的靶基因可以提高靶基因验证的准确性。因此，本研究中6个miRNAs的候选靶基因至少要被两个软件同时预测。从以往的文献中找到了25个候选靶基I因[14，15，16，17]，实时定量PCR结果证实在喉癌中有2个上调的基因和8个下调的基因。下调基因的数量多于上调基因是一个值得思考的现象，可能的原因是在喉癌的发生和进展中，抑癌基因失活比癌基因激活发挥更大的作用。这也可以解释在miRNA芯片结果中只筛查出3个下调的miRNAs，远少于上调miRNAs。miRNA是否调节某个基因通常采用荧光素酶报告基因检测系统初步判断[46]。然而，报告基因系统不能模拟体内环境会导致假阳性结果，因此，miRNA和靶基因之间的关系还需要通过westernblot在蛋白水平上验i正[47】。已有报道miR．145通过靶向YESl基因影响结肠癌细胞增殖[48】，在乳腺癌中miR．221／222通过靶向TRPSl来促进EMT[49]，在食道癌中miR．196a通过靶向ANXAl促进癌细胞增殖、抑制凋亡f501。图1．10中6个miRNAs的候选靶基因需要在体外实验和蛋白水平验证，从表1．5中可见，一个miRNA可以调节多个靶基因，而一个基因可以受多个miRNAs调节。这说34 复旦大学博士论文第一章明在体内miRNAs和mRNAs之间的相互作用形成了一个复杂的调控网络，并且保持在一个动态的平衡之中，一旦这种平衡被打破，就可能会导致疾病的发生。同样，这个网络中的miRNAs可能成为肿瘤治疗中的治疗靶点。结论本部分实验中，我们采用LCM技术获得同质的喉癌样本肿瘤细胞，采用miRNA芯片检测喉癌miRNA表达谱，筛选出26个差异表达miRNAs，最终经过扩大样本验证后，证实6个miRNAs差异表达有意义，其中一些miRNAs已经在其他肿瘤中被认为是癌基因或抑癌基因。miRNA表达谱分析会提高我们对喉癌发生发展过程中基因表达改变的认识，并且可能成为潜在的喉癌诊断和预后判断标志物。 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复旦大学博士论文第二章第二章miR．125b通过EIF2C2抑制喉鳞癌Hep-2细胞增殖研究背景失控的自主性增殖是恶性肿瘤细胞具有的主要特征之一，细胞周期校正点控制紊乱导致肿瘤细胞增殖调控异常，而前者可以是由细胞周期校正点有关的控制基因本身发生突变或异常表达所致，或是参与细胞外信号因子调节细胞增殖的跨膜信号转导通路中的蛋白编码基因发生突变或异常表达所致。除了细胞周期调控异常引起肿瘤细胞自主性增殖以外，肿瘤细胞凋亡过程减弱也是导致肿瘤不断生长的原因之一，与凋亡相关的基因(如p53、bcl．2等)异常表达可以抑制肿瘤细胞凋亡过程。第一部分喉癌miRNA表达谱研究表明，miRNA的异常表达可能与喉癌的发生、演进和转移有密切关系。癌基因的激活和抑癌基因的失活是导致头颈鳞癌发生的重要机SU[1】，而miRNA通过结合靶基因mRNA3'-UTR区的种子序列使靶基因沉默表达[2]，对于表达上调的miRNA可以导致抑癌基因部分或完全失活，对于表达下调的miRNA，可以促进癌基因的表达。miRNA也可以通过调节与肿瘤相关的信号调节因子，从而影响某些信号通路的反应，间接发挥调控肿瘤的功能。目前已发表的一些喉癌中miRNAs功能的研究多针对表达上调的miRNAs[3，4，5，6，7，8】，因此，本部分研究结合前述的喉癌miRNA表达谱，拟对表达下调的miR．125b在喉癌发生发展过程中发挥的作用进行研究。miR．125b在很多恶性肿瘤中低表达，例如肝癌[9】、前列腺癌[10]、白血病等[111，在功能研究中发现过表达miR．125b可以通过下调p53[12]、Bmf[13]、TP53INPl『14]、STAT3[15]和ARID3B[16]抑制肿瘤细胞增殖和促进凋亡，抑制肿瘤细胞迁移和转移，因此，miR．125b在肿瘤发生发展过程中发挥了重要的作用。在此部分研究中，我们选择喉鳞癌Hep．2细胞系进行miR-125b功能研究，通过在Hep．2细胞中稳定上调miR．125b表达水平，在体外和裸鼠体内分别观察到肿瘤细胞增殖受到抑制，肿瘤生长变慢，我们进一步研究miR．125b抑制Hep．2肿瘤细胞增殖的分子生物学机制，新发现miR．125b通过调节靶基因EIF2C2发挥作用。39 复旦大学博士论文第二章第一节构建过表达miR-125b的Hep．2稳转细胞株材料与方法2．1．1实验仪器及耗材旋涡混合器：MAXIMIXplusTM，Thermolyne公司；制冰机：F．120C．50型，日本HOSHIZAKI电器公司；低温高速离心机：3K30型，德国Sigma公司；PCR基因扩增仪：美国ABIPRISM9700PCR扩增仪；凝胶成像仪：ApharrnaciaBiotech公司；精密天平(BSll0S)：德国Sartorius公司；精密移液器：德国Eppendorf公司；细胞培养箱：Thermo公司实验耗材：购自Axygen、Coming公司；2．1．2实验材料及试剂：(1)细胞株及培养条件：人胚肾细胞株HEK293T和喉鳞癌细胞株Hep．2由本实验室保存；(2)细胞培养试剂：RPMI．1640、高糖DMEM培养基和胎牛血清购自Invitrogen公司，青链双抗购自Invitrogen公司；(3)细胞实验试剂：HBSS溶液、0．25％胰酶+EDTA购白Invitrogen公司；(4)菌株：大肠杆菌DH5a感受态由本实验室保存，用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒；(5)质粒：慢病毒载体系统(Tronolab)，该病毒包装系统为3质粒系统，质粒pCDH-CMV-MCS—EFl-copGFP、psPAX2和pMDLg／pRRE由本实验室保存，pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP能表达绿色荧光蛋白(GFP)，psPAX2、pMDLg／pRRE含有病毒包装所必须的元件，下面是载体序列图；慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP(简称pCDH)、psPAX2和pMDLg／pRRE图谱：见图2．1—2．3 5．pCDH·CMV-MCS-EFI-copGFP(CD511B·1)RSVS'LTRFeatures困鬻LTR器235潞4145’Xbal；精‘1孤．溺；图2．1pCDH—CMV-MCS—EF1一copGFP序列图谱NE05aclBamHc33)脚courtesyofTponoLab：http：／／ww．tronolab．unige．ch／index．him6))9J图2．2pMDLg／pRRE序列图谱41 图2．3psPAX2序列图谱(6)试剂：10mMdNTPmix：Invitrogen公司；25mMMgCl2：Invitrogen公司；100bpDNA分子量标准：Invitrogen公司；质粒中抽试剂盒：QIAGEN公司；细菌培养用胰化蛋白胨(trytone)：英国OXOID公司；细菌培养用酵母提取物(yeastextract)：英国OXOID公司；细菌培养用琼脂粉(agar)：美国Amresco公司；琼脂糖(Agarose)：西班牙Biowest公司；高保真酶P如UltraII：Agilent公司；T4连接酶：NEB公司；转染试剂：Lipofectamine2000(简称Lip02000)、opti．MEMI培养基购自Invitrogen公司，聚凝胺(Polybrene)；PCR产物凝胶回收试剂盒：Axygen公司；限制性内切酶(HpaI、XhoI、BamHI、NheI等)：NEB公司；42 复旦大学博士论文第二章2．1．3实验方法2．1．3．1细胞培养：细胞培养必须注意无菌操作!!(1)细胞培养：细胞培养在370CC02培养箱内，箱内稳定供应5％C02以调节培养基PH值，如营养耗尽，则需要更换培养基，培养条件如下：细胞株培养基HEK293T高糖DMEM+1O％FBS+1％青链双抗旦皇P：兰婴坐!：!鱼兰Q±!Q丝里呈墨±!丝童壁翌亟(2)细胞传代：当细胞生长至80．90％融合度时需进行传代，弃掉旧培养基，HBSS清洗2次，加入约1．2ml0．25％胰酶室温下放置1-2min，吸去胰酶后再放入37℃培养箱继续消化lmin，直至镜下细胞间隙增大，呈圆形，并有脱落(每种细胞都有其特定的消化时间，需在镜下观察摸索)。加入含血清的完全培养基，终止消化反应(血清可抑制胰酶活性)，用吸管将贴壁的细胞吹下来，不要用力过大以减少细胞碎片，注意尽量减少气泡产生，按1：3将细胞接种于新培养皿中，常规2．3天换液一次，3．4天传代一次，取决于细胞生长速度快慢；(3)细胞冻存：选择正处于对数生长期的细胞，消化并悬浮细胞，1000g×离心5min沉淀细胞，弃上清。用细胞冻存液1ml将细胞悬起，分装于两只细胞冻存管，并标明冻存细胞名称，冻存时间及冻存者，立即冰浴。依次将细胞冰浴1h，．20℃放置2h，．80℃过夜后转移至液氮中保存；细胞冻存液配方(1m1)：胎牛血清DMSO900Ul100ul(4)细胞复苏：取出冻存的细胞(注意液氮中冻存管如封闭不严导致液氮注入，取出后可能会爆炸!)，37-42℃(一般为40。C)水浴1~2分钟解冻。将解冻后的细胞加入少量培养基吹打混匀，1000g×离心5min，弃上清(去．除冻存液中的DMSO)，重新加入含血清的完全培养基，混匀后转移至细胞培养箱中培养。(5)细胞计数：用吸管将细胞吹匀后立即吸取少量细胞悬液，加到细胞计数板上，取四个角上大方格(图中大圆圈为其中一格，其中又有16个小格)内细胞数的平均数乘以104所得数即为lml悬液中含有的细胞数(计数细胞的原则是计上不计下，计左不计右)，如图2．4所示。43 复旦大学博士论文第二章图2．4细胞计数板示意图2．1．3．2miR．125b目的基因片段PCR扩增将含有miR．125b．1前体序列的目的基因构建到表达GFP的慢病毒载体，从而形成miR．125b．1与GFP共表达的慢病毒载体。为了提高PCR产物的特异性，我们先扩增出约550bp包含miR-125b．1cds序列的大片段，引物序列见下表。PCR产物经1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。名称引物序列miR--125b·-1Ftagaccaggcagatgagttccacaag堡i垦：!兰!!：!坠g型璺巡照墅型逝竺篷g盟壁PCR反应体积501al，体系组成如下：以人基因组DNA扩增目的片段反应条件如下：模板(100ng／u1)正向引物反向引物10×bufferdNTPMIX(各2．5mM)PfuUltraII去离子水1斗l1p11肛l5¨l0．5¨l1rtl40．5lxl1cycle30cylces1cycleHoldonPCR产物中取5ul进行电泳，鉴别条带大小是否与预期一致： 复旦大学博士论文第二章2．1．3．3miR-125b目的基因片段回收将剩余PCR产物进行凝胶电泳后回收，根据Axygen凝胶回收试剂盒说明书进行如下操作：(1)在紫外灯下切下含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量(提前记录1．5ml离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(如100m萨100ul体积)；(2)加入3个凝胶体积的BufferDE．A，混合均匀后于75"C力N热，间断混合(每2．3min)，直至凝胶块完全熔化(约6．8min)；(3)加0．5个BufferDE．A体积的BufferDE．B，混合均匀；(4)吸取上述混合液，转移到DNA制备管(置于2m1离心管中)，12，000xg离心lmin。弃滤液；(4)将制各管置回离心管，加0．5mlBufferW1，12000xg离心30S，弃滤液；(5)将制备管置回离心管，加0．7mlBufferW2，12000xg离心30S，弃滤液；以同样的方法再用O．7mlBufferW2洗涤一次12000×g离心1min；(6)将制备管置于2ml离心管中，12000xg离心1min；(7)将制备管置于洁净的1．5m1离心管中，在DNA制备膜正中央加25ulEluent，室温静置1min，12000xg离心1min洗脱DNA。在这段序列内重新设计引物，上游引物引入NheHI酶切位点，下游引物引入BamHI酶切位点，扩增miR-125b目的基因片段，引物序列如下：名称引物序列miR-125b-1Faaagctagcggcagatgagttccacaag坐i垦：!呈!垒：!堡璺丝艘丝里!堂臣臣堑匹匹照g墅坚PCR反应体系及条件与前述相同，取PCR产物中5ul进行电泳，剩余PCR产物进行凝胶电泳后切胶回收，按前述操作步骤进行。2．1．3．4miR-125b目的基因片段及慢病毒载体的双酶切及纯化回收A．分别将空载体pCDH和目的基因片段用BamHI和NheI进行双酶切反应，然后纯化酶切产物：酶切反应总体积20ul，体系组成如下：BamHI(10U／lxl)1肛1NheI(10U／lxl)1“l10xbuffer2Hl目的基I园／PlasmidDNA(500ng／p1)10“l去离子水6¨l 复旦大学博士论文第二章反应条件如下：37℃，4小时；B．酶切反应产物的纯化，根据Axygen试剂盒说明书进行如下操作：(1)在酶切反应液中加入3个体积的BufferPCR．A，即120ul；(2)混匀后，转移到DNA制备管置于21111离心管中，12000×g离心1min，弃滤液；(3)将制备管置回2ml离心管，加0．7mlBufferW2，12000xg离心1min，弃滤液；(4)将制备管置回2111l离心管，加0．4mlBufferW2，12000xg离心1min；(5)将制备管置于洁净的1．5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25ulEluent，室温静置1min，12000xg离心1min洗脱DNA。2．1．3．5miR-125b目的基因片段与慢病毒载体连接及转化A．将双酶切载体和目的基因片段进行连接反应，连接反应体积15．5ul，体系组成如下：pCDH载体(0．1ug／u1)酶切目的基因10xT4bufferT4DNA连接酶5gl8pl1．5pl1“l反应条件：4℃，连接过夜。B．将连接产物转化大肠杆菌DH5a：(1)将20“l连接反应产物加入100p1已常温溶化的DH50【感受态大肠杆菌中，冰浴30mira(2)经42℃、90s热休克，再冰浴1．2min；(3)加入600肛I不含抗生素的LB液，水平摇床37℃250rpm45mira(4)均匀涂布于已铺LB且含100mg／ml氨苄霉素的平板上，37。C正放1h后，倒置于37℃孵箱中培养过夜。4。C保存备用。2．1．3．6克隆菌液PCR及测序鉴定(1)用高压灭菌的牙签挑取单个克隆到3ml有抗性的LB中，水平摇床37。C250rpm过夜，标记好每个克隆；(2)，然后用灭菌的枪头吸200肛1菌液到EP管中，100℃煮5min，然后4℃12000rpm离心10min，吸lgl上清液做模板用；(3)按照大肠杆菌中预期包含的质粒，混合20ulPCR体系，模板为上面煮过的细菌上清1ul；(4)按照前述PCR扩增的反应条件进行；(5)1．5％琼脂糖凝胶电泳后看结果，见图2．5，阳性菌落对应的菌液送测序鉴定， 复旦大学博士论文第二章测序正确则扩增备用。图2．5菌液PCR鉴定阳性克隆2．1．3．7慢病毒表达载体生产及包装制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染HEK．293T细胞，转染后4-6h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心纯化成不同浓度的浓缩病毒，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。慢病毒生产实验步骤：(1)细胞准备：胰酶消化对数生长期的HEK．293T细胞，重新接种于10cm细胞培养皿，37。C5％C02培养箱内培养；(2)当细胞融合度达70％～75％时转染：吸去培养基，用无菌的PBS洗一次，加入5ml无血清培养基；(3)制备慢病毒包装系统三种质粒DNA混合溶液：pCDH-miR-125b表达质粒8p．g／pCDH—vector(空载质粒)psPAX2质粒6ggpMDLg／pRRE质粒2P．g(4)加入opti．MEMI至500gL，室温放置5min；另外取一无菌EP管，加入450}tLopti—MEMI，然后加入509Llip02000，室温放置5min；然后将脂质体缓慢加入质粒DNA中，轻柔混匀，室温放置20min；(5)将DNA和脂质体混合液转移至含单层细胞的无血清培养基中，混匀，培养4．6h后弃去含有转染混和物的培养液，加入PBS15ml，轻摇后弃去，重复清洗3次；(6)每盘细胞中加入含10％胎牛血清的细胞培养基15ml，继续培养；47 复旦大学博士论文第二章(7)当细胞培养基变黄时，收集转染的293T细胞上清液；重新加入新鲜含10％胎牛血清的细胞培养基，继续收集病毒，个人一般收集2次；(8)将收集的上清液于4"C，4000g离心10min，收集上清液；(9)将上清液以O．45肛m滤器过滤，分装于2ml的EP管备用。2．1．3．8慢病毒感染Hep．2细胞接种Hep．2细胞于两盘6cm培养皿中，当细胞融合度达到30．45％左右时，分别加入3ml慢病毒pCDH．miR．125b表达质粒和pCDH空载质粒病毒上清，同时加入2ml含10％胎牛血清的细胞培养液，加入polybrene至终浓度4-Sug／ml，24h后更换为正常培养基，48h后荧光显微镜下观察细胞感染效率，感染效率至少达到70％，病毒感染视为合格。细胞传代分盘培养，抽提总RNA鉴定miR-125b表达水平。RNA抽提、加poly(A)尾反转录和荧光定量PCR操作步骤与第一部分相同。实验结果2．1．4．1pCDH．miR-125b和pCDH-veetor慢病毒表达载体构建：我们将包含miR-125b前体序列的目的基因从基因组中扩增出来，通过基因工程技术克隆至pCDH—CMV-MCS．EF1一copGFP慢病毒表达载体内，pCDH．miR-125b慢病毒表达载体除了表达miR-125b，可以同时表达绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)，可以方便的在荧光显微镜下观察转染效率和病毒感染效率。通过感染喉鳞癌Hep．2细胞使miR-125b得到稳定、持续表达。不含目的基因片段的空载质粒pCDH．vector作为对照。2．1．4．2慢病毒载体混合质粒转染HEK-293T细胞的转染效率观察：慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒共转染HEK．293T细胞，转染后4-6h更换为完全培养基，在培养24、48h时间点，荧光显微镜下观察转染效率，见图2．6。收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过离心纯化成不同浓度的浓缩病毒，进一步超离心浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，供感染Hep．2细胞用。 复E1．人学博Ij论文第二章A．B．图2．6慢病毒载体混合质粒转染效率观察。A．转染293T细胞24hGFP×50：B．转染293T细胞48hGFP×502．1．4．3慢病毒感染Hep．2细胞效率观察：慢病毒感染Hep一2细胞后，分别在6h、12h、24h倒置显微镜下观察细胞形态，感染24h后更换正常培养基，48h后荧光显微镜下观察Hep．2．pCDH．miR．125b和Hep-2-pCDH-vector(分别简称Hep-2一miR一125b和Hep．2．vector)GFP表达情况，计算产生绿色荧光细胞占总细胞的比例，pCDH慢病毒感染效率在80％以上，两株细胞阿细胞形态无明显差别。见图2．7。感染成功后传代冻存，供后续鉴定及功能研究用。49 复口．大学博一ij论文 复口．人学博lj论文笙三皇．．11．图2．7慢病毒感染Hep．2细胞后细胞形态及感染效率A．Hep．2．miR一125b200×，B．Hep一2-vector200×，C．Hep-2·miR-125bGFP100×，D．Hep-2-vectorGFP100x，E．Hep-2-miR-125bGFP200x．F．Hep一2一vector200x2．1．4．4Hep．2．miR．125b和Hep．2．vector细胞miR．125b相对表达鉴定6cm培养皿分别培养Hep．2．miR．125b和Hep．2．vector细胞，待细胞长满后，收获细胞提取总RNA，分别进行加poly(A)尾反转录和普通反转录(普通反转录的cDNA模板供后续实验使用)，荧光定量PCR检测两株细胞miR．125b相对表达水平，采用2‘△△Q方法计算并进行t检验，设定P值<0．05有统计学意义，结果见表2．1和图2．8，可见Hep一2．vector细胞自身的miR．125b表达水平比较低，Hep．2．miR．125b细胞株的miR．125b相对表达量远高于Hep．2．vector细胞株，并且慢病毒感染后miR．125b可以持续稳定在此株细胞表达，可以利用这两株稳转细胞进行miR．125b的功能研究。 复呈奎兰堕主论文第二章表2．1荧光定量PCR结果1．O．miR-125b相对表达黼p<0．0001图2．8H印一2一miR_125b和Hep-2·vector细胞株比较52面客Jc旦唆警LA×山02_墨。比 复旦大学博士论文第二章第二节miR-125b对喉癌Hep．2细胞增殖的影响材料与方法2．2．1实验材料及试剂：(1)细胞株：构建的Hep．2．miR．125b和Hep．2．vector细胞；(2)细胞培养试剂：RPMI．1640、高糖DMEM培养基和胎牛血清购自Invitrogen公司，青链双抗购自Invitrogen公司，培养条件与前述相同；(3)细胞实验试剂：HBSS溶液、0．25％胰酶+EDTA购自Invitrogen公司；(4)试剂：CellProliferationReagentWST-1试剂盒购自Roche公司；AnnexinVPEApoptosisDetectionKitPE试剂盒购自eBioscience公司；碘化丙啶(propidiumiodide，PI)染液购自Invitrogen公司；(5)实验动物：SPF级NOD／SCID免疫三缺陷雄性小鼠，4～6周龄，体重18．209，购自上海中科院动物实验中心；饲养条件：恒温、恒湿、隔音、空气层流过滤、隔离无菌环境，自由社区无菌水和灭菌标准饲料，独立光照系统(12小时光照，12小时黑暗)。动物实验也在该SPF级动物实验室进行，严格无菌操作。2．2．2实验仪器：国产细胞计数板；细胞培养箱：Themo公司；细胞培养耗材：Coming公司；光学显微镜、荧光显微镜：olympus公司；2．2．3实验方法：2．2．3．1WST-1实验观察miR．125b对Hep．2细胞增殖：(1)细胞铺板：收集对数生长期细胞，两组分别为Hep．2．miR-125b和Hep．2．vector细胞，调节细胞密度，在96孔板中加入5×103个／孔细胞，每孔加入细胞培养基lOOul，37。C培养。每组设5个复孔，每板另设单孔只有细胞培养基不加细胞的背景对照；(2)显色：分别在培养Oh、24h、48h、72h和96h后，每孔加WST-1溶液10ul，37。C孵育2小时；(3)LL色：选择450nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔吸光度值(OD)，记录结果， 复旦大学博士论文第二章以时间为横坐标，平均吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。分别观察Hep-2-miR一125b和Hep．2．vector细胞连续4天的增殖情况。2．2．3．2流式细胞术0FCM)细胞凋亡检测：(1)试剂准备：用双蒸水稀释10×BindingBuffer至1x浓度；(2)细胞准备：收集对数生长期的细胞，0．25％胰酶消化，用预冷的PBS洗涤一次，1000rpm离心5min弃上清，再用1×BindingBuffer洗涤一次，1000rpm离心5min弃上清；用l×BindingBuffer重悬细胞，调整浓度至1．5×106个／ml；(3)染色：加5ulPE标记的AnnexinV染料至100ul上述细胞悬液内，避光室温静置10—15min；(4)用1×BindingBuffer洗涤细胞一次，重悬至200ull×BindingBuffer；(5)流式细胞检测：加5ul7-AAD染料至细胞悬液，轻混后4h内上流式细胞仪检测，CellQuest软件分析结果。2．2．3．3流式细胞术细胞周期检测：(1)细胞准备：分别接种Hep．2一miR．125b和Hep．2．vector细胞至6cm培养皿，调整细胞密度大致相同，细胞贴壁后更换为无血清细胞培养基，保持两组细胞细胞周期同步化，培养24h后更换为正常含血清培养基，继续培养24—48h，胰酶消化收集细胞，弃上清，用预冷的PBS洗涤细胞两次；(2)细胞固定：加入预冷的70％乙醇，4℃固定过夜或．20℃保存；(3)细胞染色：离心收集细胞，lmlPBS洗细胞一次，加入500ulPI(含50ug／mlPI，100ug／mlRNaseA，O．2％TritonX．100)染色液，4。C避光孵育30min；(4)流式细胞分析：上流式细胞仪检测，ModFitLT2．0软件分析细胞周期分布，实验重复3次。2．2．3．4NOD／SCID小鼠皮下移植瘤形成实验：(1)细胞准备：分别取对数生长期Hep．2．miR-125b和Hep．2．vector细胞，以0．25％胰蛋白酶消化，收集细胞，用预冷的HBSS洗涤细胞两次，用无血清培养基悬浮细胞，调整两组细胞密度相同至1×107个／ml备用。(2)小鼠准备：取12只雄性NOD／SCID小鼠，随机分成2组：Hep．2一miR．125b细胞注射组和Hep．2．vector细胞注射组，注射部位在小鼠右侧腋下靠近背部，酒精消毒注射部位皮肤，用lml注射器抽取0．2ml肿瘤细胞悬液接种于皮下。(3)移植瘤生长情况观察及标本处理：记录两组第12、15、19、22、25和28天时肿瘤的最大长径(L)和与之垂直的最大宽径(d)短径，在第28天颈椎脱位处死小鼠，剥取实体瘤块并秤重。观察指标：计算肿瘤体积(Tumorvolume，Tvl，Tv=L·d2／2，绘制两组按各时间点的平均肿瘤体积的生长曲线。54 复旦大学博士论文第二章2．2．3．4统计学分析所有数据用均数士标准差C炷S)表示，应用SPSSl3．0软件，采用OnewayANOVA方法对实验数据进行统计学分析，按p<0．05差异有显著性意义。实验结果2．2．4．1过表达miR-125b对Hep-2细胞增殖的影响我们已经验证miR-125b在喉癌组织中低表达，为了观察miR．125b对喉癌Hep．2细胞增殖的影响，我们构建了能够稳定高表达miR-125b的Hep．2．miR．125b稳转株和miR-125b表达无改变的Hep．2．vector细胞株，通过WST-1实验观察两组细胞增殖能力的变化。两组细胞各时间点450nmOD值比较，Hep．2．miR-125b组的OD值均低于Hep．2．vector组(见表2．2)，两组之间差异有明显统计学意义(见图2．9p<0．0001)，说明miR．125b对Hep．2细胞的增殖有抑制作用。表2．2WST-1实验两组细胞各时间点450nmOD值组别24h48h72h96hHep-2一vector0．4345士0．02080．7925士0．11371．1206士0．09541．0187士0．0547旦旦墅：兰：坐i垦：!兰!鱼Q：!!至坚Q：Q!Q全Q：!12坚Q：Q!!!Q：Z鱼!Z圭Q：Q兰21Q：Z丝!圭Q：Q兰!鱼。三日>aoCurveofcellproliferation蜮p<0．0001+Hep-2-vector+Hep-2一miR-125b图2．9Hep．2．miR-125b和Hep一2-vector细胞生长曲线55 复旦大学博士论文第二章2．2．4．2过表达miR-125b对Hep．2细胞周期的影响为了探讨上调miR．125b后Hep．2细胞增殖受到抑制的机制，我们采用流式细胞术检测细胞DNA含量以分析两组细胞细胞周期的分布比例。Hep．2．miR．125b细胞中Go．G】期细胞比例高于Hep．2一vector细胞，相应的S期细胞比例低于Hep．2．vector细胞，差异有统计学意义(木木p=O．013，见表2．3和图2．10．2．11)，由此可见，miR．125b过表达后，可以抑制细胞周期从Go．Gl期进入S期。表2．3两组细胞在细胞周期中各期细胞分布比例组别Go．G1期木木S期G2-M期Hep-2一miR-125b60．60％+5．95％25．31％土2．31％13．68％+4．33％旦望：兰：!篁里!Q!垒!：!至墅圭!：呈Z堑12：鱼2堑圭2：21堑!鱼：垒Z墅圭Z：兰至堑图2．10两组细胞细胞周期中各期细胞分析：‘：IJI量‘：I‘一；人LAJ，⋯’品’一j5n-⋯．!i～?50一j!。～。Channe心⋯。’一。 复旦大学博士论文第二章2．2．4．3过表达miR-125b对Hep．2细胞凋亡的影响由于pCDH载体能够表达绿色荧光蛋白(OFP)，为了避免GFP的干扰，我们采用发射红色荧光的荧光探针PE标记的AnnexinV检测细胞凋亡，利用AnnexinVPE／7．AAD双标法检测结果表明，Hep．2一miR．125b细胞中凋亡细胞比例为6．86％+2．45％，与Hep一2．vector细胞组5．02％+1．90％比较，差异没有统计学意义f木冰P=O．36，表2．4和图2．12)，表明miR一125b使Hep一2细胞停滞在Go．Gl期，但没有促进凋亡过程。表2．4Hep．2．miR．125b和Hep一2-vector凋亡细胞比例组别凋亡细胞比例牛木Hep一2-miR-125b6．86％+2．45％垡望：呈：∑型Q!!：Q垄堑圭!：竺Q堑A．Hep．2．miR．125b细胞凋亡B．Hep．2．vector细胞凋亡图2．12流式细胞仪检测细胞凋亡细胞分布2．2．4．4miR．125b上调后抑制NOD／SCID小鼠皮下移植瘤形成NOD／SCID小鼠是T细胞系缺陷、B细胞系缺陷、NK细胞活性低下，但小鼠外观与普通小鼠无异，体重发育正常。NOD／SCID小鼠皮下移植瘤形成实验分为两组，分别为Hep．2．miR一125b细胞注射组和Hep．2一vector细胞注射组。于小鼠右侧腋下靠近背部皮下注射2×106个肿瘤细胞悬液，形成直径3mm左右的皮下隆起，次日隆起逐渐吸收，7天后出现皮下实心结节，各组小鼠肿瘤周围皮肤均完好，无红肿、破溃、结痴，无动物死亡。在各时间点根据肿瘤的长径和短径计算各组肿瘤平均体积，绘制按时间点的各组肿瘤平均体积的曲线，结果显示在体内实验结束时(注射后第28天)， 复旦大学博士论文第二章Hep．2．vector组的肿瘤平均体积为422．064-134．69mm3，Hep．2．miR-125b组的肿瘤平均体积分别为245．964-82．28mln3，Hep．2．miR-125b组的肿瘤平均体积小于Hep．2．vector组，差异有显著性(料P<0．001，见表2．5、图2．13)。在第28天处死裸鼠(图2．14)，剥离瘤体，肿瘤成多结节，表面无溃破，秤重肿瘤，两组间肿瘤平均重量差异有显著性(★★P