利用串联亲和纯化研究ehec o157h7 ⅲ型分泌系统分子伴侣蛋白复合物

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1、分类号S852.3学校代码10129UDC619学号2009301028利用串联亲和纯化研究EHECO157:H7III型分泌系统分子伴侣蛋白复合物AnalysisofTypeThreeSecretionSystemChaperoneProteinComplexesofEHECO157:H7byTandemAffinityPurification申请人：魏波学科门类：农学学科专业：预防兽医学研究方向：寄生虫病及防治指导教师：呼和巴特尔教授岳俊杰副研究员论文提交日期：二〇一二年六月摘要肠出血型大肠杆菌O1

2、57:H7是重要的人类肠道致病菌，III型分泌系统复合物及其分泌的转运蛋白和效应蛋白在其致病过程中发挥着重要作用。本研究以III型分泌系统的分子伴侣蛋白CesT和CesD为出发点，通过串联亲和纯化（TAP）和非变性凝胶电泳（BNPAGE）为核心的复合物组学方法，分离靶蛋白参与形成的复合物，利用质谱技术鉴定参与靶蛋白复合物形成的蛋白组分，最后构建以靶蛋白为核心的蛋白相互作用网络。技术路线为：在O157:H7中表达融合了TAP标签的毒力蛋白，以温和的方式裂解细菌，制备蛋白复合物样品，通过串联亲和纯化技术捕获

3、并富集靶蛋白参与形成的复合物；经BNPAGE分离为独立的复合物条带，质谱鉴定每个复合物条带的蛋白成分，通过GSTpull-down验证复合物组成蛋白间的相互作用关系。本课题设计并构建了两个TAP表达载体pNTAP和pCTAP，分别将TAP标签融合于靶蛋白的N末端和C末端。首先以大肠杆菌中大量存在的分子伴侣GroEL为前期试验对象，建立了成熟的串联亲和纯化技术，分离鉴定到由靶蛋白形成的复合物，并且纯化产物中没有其它的蛋白复合物，表明串联亲和纯化的特异性好。然后以III型分泌系统的分子伴侣蛋白CesT和Ce

4、sD为靶蛋白，都分离鉴定到了含靶蛋白的复合物，且没有非特异条带，进一步表明串联亲和纯化的特异性较好。以CesT为靶蛋白捕获的复合物，其中的两个组成蛋白EF-Tu和GK（甘油激酶）分别通过GSTpull-down实验证明了它们与靶蛋白CesT有直接相互作用。本研究结果表明：建立了高效的以TAP和BNPAGE为核心的复合物组学技术，能够在大肠杆菌中比较特异地分离鉴定由靶蛋白参与形成的蛋白复合物，并分析组成蛋白间的相互作用关系；该技术不仅能用于大肠杆菌，还能应用于痢疾杆菌等其它病原菌。本研究的完成，对构建以I

5、II型分泌系统相关毒力蛋白为核心的蛋白相互作用网络，全面地研究III型分泌系统作用机理，提供了坚实的理论基础和技术保障。关键词：肠出血型大肠杆菌O157:H7；分子伴侣；串联亲和纯化；蛋白质复合物AnalysisofTypeThreeSecretionSystemChaperoneProteinComplexesofEHECO157:H7byTandemAffinityPurificationAbstractEnterohemorrhagicEscherichiacoli(EHEC)O157:H7isa

6、nimportantcausiveagentofhumanintesinaldiseasewhichexpressesaTypeThreeSecretionSystem(TTSS)playingasignificantroleincolonisationandresponsibleforitspathogenesisforhumanandanimalhost.TTSSiscomposedofstructuralproteins,secretedtranlocatorproteins,secretedef

7、fectorproteinsandchaperones,allofwhichcontributedtothevirulenceofEHEC.Inthepresentstudy,acomplexomicsapproachcomposedoftandemaffinitypurification(TAP)andbluenativePAGE(BNPAGE)isdeveloped.Subsequently,separationandpurificationofproteincomplexescontainingt

8、argetvirulenceprotein(CesTorCesD)andidentificationofnovelvirulenceproteinswereconductedwiththedevelopedapproach.Theexperimentalschemeofthisstudycanbedetailedasfollowed:Firstly,TAP-taggedvirulenceproteinswereexpressedinO157