蟾毒灵对人肝癌细胞株增殖迁移侵袭黏附能力的影响及其机理研究

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1、复旦大学硕士学位论文蟾毒灵对人肝癌细胞株增殖迀移侵袭黏附能力的影响及其机理研究Theeffectandmechanismofbufalinontheproliferation,migration,invasionandadhesionofhumanhepatomacelllines院系:中山医院专业：中西医结合临床(肿瘤方向)姓名：仇冬则导师:杨云柯副教授组成员：李立新副主任医师王国骅主治医师目录中文摘要-1英文摘要4miW8第一部分bufalin对人肝癌细胞株增殖、迁移、侵袭、黏附的影响觀12方法12@果1525第二部分bufalin抑制人肝

2、癌细胞株增殖、迁移、侵袭机理研究MI429施3034i描43全文小结48参考文献48文献综述53觀60蟾毒灵对人肝癌细胞株增殖迁移侵袭黏附能力的影响及其机理研究摘要研究背景原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤，死亡率高，在恶性肿瘤导致死亡的原因中居第三位。相当多的肝癌发现时已是晚期，即使是接受根治手术的病人术后5年仍有30%至40%的复发率。晚期肝癌病人的中位生存时间为6到8个月，对于晚期肝癌的病人还没有有效的治疗方法。因而寻找肝癌治疗的新靶点具有重要的临床意义。研究发现我国临床上常用的抗肿瘤中成药蟾酥制剂的有效成分强心苷类物质蟾毒灵（bufalin)

3、具有抑制肿瘤细胞株增殖、诱导凋亡、逆转耐药细胞株耐药的作用，并发现bufalin可以抑制肿瘤细胞株Akt的磷酸化。Akt磷酸化后引起调节蛋白表达的改变在肿瘤的生长、增殖、凋亡、运动、上皮间质转化、血管生成和转移中发挥重要作用。而bufalin对人肝癌细胞株侵袭迁移的作用尚未见报道，预实验研究表明bufalin可以抑制HCCLM3细胞株体外迁移，但其作用机理还不明了，其抑制肿瘤细胞迁移是否与抑制Akt磷酸化继而影响下游调节蛋白的表达还有待研究，本实验将从体外实验探讨bufalin对人肝癌细胞株增殖、迁移、侵袭、黏附的影响及其与Akt信号通路关系，

4、以期为蟾酥制剂的抗肿瘤作用尤其是抑制肿瘤侵袭方面提供实验依据。研究目的本研究从体外实验观察bufalin对人肝癌细胞株HCCLM3、HepG2增殖、迁移、侵袭、黏附生物学行为的影响，并以Akt为靶点，研究bufalin对Akt信号通路相关蛋白Akt、pAkt(Ser473)、pGSK-33(Ser-9)、GSK-3P、P-catenin(Ser33/37)、0-catenin、E-cadherin的表达及P-catenin核易位的影响，探讨bufalin对Akt—GSK-3P一P-catenin一E-cadherin信号通路的影响及其抑制肿瘤增

5、殖、迁移、侵袭、黏附作用的机理。研究方法体外实验评价bufalin对人肝癌细胞株HCCLM3、HepG2增殖、迁移、侵袭、黏附作用的影响。通过CCK8法评价bufalin对人肝癌细胞株的增殖抑制作用；划痕实验及Transwell-migration模型评价bufalin对人肝癌细胞株迁移能力影响；Transwell-invasion模型评价bufalin对人肝癌细胞株侵袭能力的影响；黏附实验观察bufalin对人肝癌细胞株點附能力的影响。Westernbolt检测Akt、pAkt(Ser473)、pGSK-3P(Ser-9)、GSK-33、0-

6、catenin(Ser33/37)、P-catenin、E-cadherin的表达，细胞免疫荧光检测0-catenin核易位情况及E-caherein的表达。结果1、Bufalin对人肝癌细胞株HCCLM3、HepG2细胞株增殖的影响HCCLM3经Onmol/L、lnmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L、lOOOOnmol/L、lOOOOOnmol/Lbufaliln处理48h后的增殖抑制率分别为0.071士0.076、0.241±0.024、0.485±0.009、0.777±0.005、0.834±0.17

7、5、0.871±0.007。HepG2相应的抑制率分别为：0.208±0.029、0.350±0.050、0.486±0.019、0.793士0.011、0.835±0.013、0.886土0.016。GraphPadPrism5.0计算HCCLM3的IC50(48h)为66.90mnol/L，HepG2的IC50(48h)为97.43nmol/L。2、Bufalin对人肝癌细胞株HCCLM3、HepG2细胞株迁移的影响划痕实验发现,HCCLM3经Onmol/L'、lnmol/L、1Onmol/L,100nmol/Lbufaliln处理24h后

8、，迁移率分别为0.453±0.028、0.251±0.036、0.175±0.022、0.117±0.027，相应药物处理48h后迁移率分别为0.65