沉默fak基因表达对人肝癌细胞株hcclm3增殖、迁移、凋亡的影响

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1、中山大学硕士学位论文沉默FAK基冈表达对人肝癌细胞株HCC-LM3增殖、迁移、凋亡的影响沉默FAK基因表达对人肝癌细胞株HCC．LM3增殖、迁移、凋亡的影响摘要原发性肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)的发病率在我国居恶性肿瘤发病率的第二位。全国每年新增肝癌病人13万余例，占全世界每年新增病人的40％"-'50％。以外科切除为主的综合治疗是目前最有效的治疗方法，但中晚期肝癌往往因多种原因影响治疗效果，如肿瘤转移、肿瘤过大或侵犯血管等。目前尚缺乏有效的手段应对肝癌术后高复发，高转移率。研究肝癌侵袭、转

2、移的机制有助于寻找新的治疗策略，而这已成为当前肝癌研究的重点。肿瘤细胞在整合素介导下与细胞外基质(ExtracellularMatrix，ECM)粘附是肿瘤细胞侵袭、转移的重要原因之一，在整合素介导的信号转导中粘着斑激酶(FocalAdhesionKinase，FAK)起关键作用。FAK足一种非受体酪氨酸激酶，它在细胞间及细胞与细胞外基质粘附中起关键作用。研究证明，FAK在乳腺癌、宫颈癌、直肠癌、甲状腺癌、前列腺癌、喉癌、舌癌、肺癌中表达量增高，高表达FAK通常与差的病理分型和预后相联系，并且已经在一些实体肿瘤如乳腺癌中探索

3、了其活化机制以及其通过下游信号传导通路参与细胞周期调控、粘附、侵袭、转移等的作用方式。但是对于肝癌中FAK介导肿瘤细胞生物学活性的相关研究甚少，目前尚不清楚FAK在肝癌细胞侵袭、转移、增值、生存、凋亡过程中所处地位。本课题拟以肝癌细胞株为研究对象，构建质粒转染并筛选出稳定低表达FAK的细胞株，初步探讨下调FAK表达对肝癌细胞迁移和增殖产生的影响，以及为今后对其分子机制研究打下基础。目的：应用RNA干扰技术，构建针对人粘着斑激酶FAK的shRNA表达载体，研究沉默FAK的表达对人类肝癌细胞LM3增殖、迁移能否产生影响。2中山人

4、学硕士学位论文沉默FAK基冈表达对人肝癌细胞株HOC-LM3增殖、迁移、凋亡的影响方法：根据GenBank数据库提供的FAK基因序列(GI：439874)构建FAK基因shRNA的重组质粒FAK．pSuper-shRNA。经测序鉴定后，在脂质体的介导下转染入包装病毒细胞PHOENIX，优化筛选条件，以lug／ml嘌呤霉素筛选3~4周获得阳性克隆，以病毒包装细胞上清滤液感染LM3细胞株，Iug／ml嘌呤霉素的完全培养基筛选培养，40d左右获得不同抑制率的阳性克隆，选取抑制率最高稳定表达细胞株命名为LM3．pSuper-FAK。

5、通过Westemblot检测抑制效率并应用划痕实验、流式细胞术、MTT实验比较LM3．pSuper-FAK组与对照组迁移、凋亡及增殖的区别。结果：(1)成功构建重组质粒FAK．pSuper-shRNA并经测序鉴定基因序列正确。(2)筛选最佳浓度，实验显示lug／ml嘌呤霉素筛选时为细胞最小致死浓度。(3)Westernblot：转染重组质粒FAK．pSuper-shRNA后能使肝癌细胞LM3的FAK蛋白的表达下调。根据筛选的不同阳性克隆可有不同的抑制率。其中抑制率最高的克隆下调FAK表达为59．65％。(4)细胞划痕试验显示

6、下调FAK明显抑制细胞迁移能力。(5)流式细胞仪测定细胞周期及凋亡：下调FAK表达后LM3细胞细胞增殖指数为36．9％，对照组为61．1％，差别有统计学意义(p

7、增殖、迁移能力，为后续研究以及肝癌的基因治疗奠定了基础。关键词：RNA干扰，肝癌，粘着斑激酶，增殖，迁移3中山人学硕士学位论文沉默FAK基因表达对人肝癌细胞株HCC-LM3增殖、迁移、凋亡的影响EffectsofsilencingFAKgeneexpressionbyRNAioncellmigration，invasionand一一■●PJ●●-l‘-一-‘prollIeratlonlnIIamanliverCailcercellline·HCC．LM3ABSTRACTHepatocellulalcarcinoma(HCC)

8、isoneofmostcommonmalignanttumors，anditsincidencehasclimbedtothesecondplaceamongothermalignanttumorsinChina．Thereale130thousandsnewlyhappenedHCCse