蛋白酶激活受体2基因沉默对肝癌smmc-7721细胞增殖和侵袭迁移能力的影响

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1、河北医科大学硕士学位论文蛋白酶激活受体2基因沉默对肝癌SMMC--7721细胞增殖和侵袭迁移能力的影响姓名：赵建业申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：谢立群201203中文摘要蛋白酶激活受体2基因沉默对肝癌SMMC．7721细胞增殖和侵袭迁移能力的影响摘要肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是临床最常见的恶性肿瘤之一，全球每年肝癌患者增加约六十万，居恶性肿瘤的第五位。我国是乙肝大国，乙肝肝硬化后患肝癌几率增加，目前我国肝癌发病人数约占全球肝癌病人的55％。肝癌恶性程度高，目前虽然有手术切除、射频消融及介入治疗等众多

2、治疗方法，但是临床发现肝癌多处于中晚期，治疗效果不理想。肝癌的高死亡率与其高侵袭转移能力密切相关。明确肝癌的侵袭和转移的途径，并确定在这个过程中的关键基因，对肝癌的治疗将提供强有力的预后标志物和分子靶向药物。蛋白酶激活受体．2(Proteinase．acfivedreceptors2，PAR-2)是一种存在于细胞膜上的与G蛋白相偶联的受体，胰蛋白酶等是该受体的天然激动剂，人工合成的小分子多肽如SLIGKV．NH2也能够激活该受体。我们的前期研究发现肝癌组织PAR-2表达较癌旁组织升高，肝癌细胞HepG2、SMMC．7721也表达PAR-2。RNA干

3、扰技术是将一段双链的小分子RNA导入细胞，使具有同源序列的基因表达受到抑制。RNAi技术已被越来越多地用于研究肿瘤的致病因素及探索对其进行有效的基因治疗等方面。利用RNAi技术，抑制肿瘤细胞内癌基因和抑癌基因的表达，分析其表型变化，利于揭示肿瘤的发生发展的分子机制，为肿瘤诊治提供标志和治疗靶点。目的：本试验通过体外培养人肝癌细胞SMMC．7721并建立PAR．2基因沉默的稳定细胞株，研究PAR-2短发夹RNA(shorthairpinRNA，shRNA)对人肝癌SMMC一7721细胞增殖和迁移等的抑制作用。方法：l靶向PAR-2的shRNA质粒表达

4、载体的构建与筛选：首先体外合成3条靶向PAR-2基因的shR_NA，分别插入pGFP．V-Rs质粒中构建3个shRNA表达载体(shRNA．PAR．2．1、shRNA．PAR．2．2、shRNA—PAR-2．3)，并转染到SMMC一7721细胞中，然后嘌呤霉素筛选出稳定干扰PAR-2基因的细胞株，Realtime--PCR法检测稳定细胞株中shRNA对PAR-2基因中文摘要表达的抑制作用，筛选出最佳干扰序列并检测PAR-2基因的干扰效率。2流式细胞术及MTr法检测shRNA-PAR-2对SMMC．7721细胞增殖能力及周期的影响奄3粘附实验检测细胞

5、黏附力。4Transwell小室法检测PAR-2沉默前后细胞侵袭和迁移力的变化。结果：l利用RNA干扰技术成功建立了PAR-2基因下调的稳定细胞株，与SMMC一7721细胞对照组比较，sbRNA·印AR．2。l组PAR-2．mRNA表达水平较正常细胞组降低99％，s】隙NA卅AR。2．2组及shRNA--PAR-2．3组PAR-2一mRNA表达水平较正常细胞组降低90％，乱序组PAB-2-mRNA表达水平较正常细胞组无降低，s培斟A—-PAR．2．1组，s撼斟A_AR．2。2组及shRNA--PAR-2．3组PAR-2．mRNA表达水平降低有统计学

6、意义。2流式细胞术检测shRNA--PAR-2，1SMMC．7721细胞及正常SMMC．7721细脆，显示s姗嘴A—．PAR．2．1SMMC．7721细胞发生S期阻滞，转染24、48、72小时S期细胞分别由正常的(17．7圭2。91)％、(16。8圭2．48)％、(18．24-2．86)％升至(30．60+2．73)％、(20．2+1．54)％和(30。54-2。85)％。3粘附实验检测细胞黏附力，沉默组SMMC，7721细胞对matrigel的粘附能力显著降低。4Transwell小室法检测PAR-2基因沉默前后细胞侵袭和迁移能力变化：在侵袭试验

7、中，shRNA--PAR-2．1SMMC．7721细胞水解破坏matrigel胶穿过聚碳酸酯膜的细胞数低予对照组，差异有统计学意义。迁移试验中shRNA--PAR-2．1SMMC．7721细胞经变形运动穿过聚碳酸酯膜的细胞数低于对照组，差异有统计学意义尊5MTT检测shRNA--PAR-2．1SMMe．7721细胞，显示shRNA--PAR-2．1SMMC．7721细胞增殖低于对照组，PAR-2沉默对SMMC．7721细胞增殖具有抑制作用，转染试剂和阴性质粒转染对SMMC．7721细胞的生长抑制不明显。结论：l成功构建靶向PAR-2基因沉默的质粒表

8、达载体，并筛选出抑制效果最佳的表达载体shRNA-PAR-2．1，并成功获得PAR-2基因下调的稳定细胞株2中文摘要shl