肠出血型大肠埃希菌o157h7 espf蛋白靶向结合线粒体并诱导细胞凋亡的研究

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文肠出血型大肠埃希茵0157：H7EspF蛋白靶向结合线粒体并诱导细胞凋亡的研究EnterohemorrhagicEscherichiacoli0157：H7EspFTargetstoMitochondriaandInducesApoptosis专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员病原生物学郭俊研究员胡立勇教授柯昌文主任技师张仁利主任技师芮勇宇教授论文评阅人施庆珊研究员李凌副教授2012年5月20日㈥IIIIIIIllIIIIIIllIIlY2257613硕士学位论文肠

2、出血型大肠埃希菌0157：H7EspF蛋白靶向结合线粒体并诱导细胞凋亡的研究一、研究背景和目的硕士研究生：周莹指导教师：万成松教授赵卫教授摘要肠出血型大肠埃希菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoil，EHEC)0157：H7是一种食源性人畜共患肠道病原微生物，可引起人和动物严重的腹泻、出血性肠炎(haemorrhagiccolitis，HC)、溶血性尿毒综合症(Haemolyticuraemicsyndrome，HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(thromboticthromobocytop

3、enicporpura，TTP)等。1983年，Riley等首次报道了发生在美国的肠出血型大肠埃希菌0157：H7弓I起的严重食源性疾病一出血性结肠炎。此后，由EHEC0157：H7引起的散发病例和小型暴发在世界范围内不断发生。2000年，据世界卫生组织(WHO)报告，在加拿大Ontario市Walkerton区发生了一起5000人口的EHECOl57：H7的暴发流行，其中27人住院治疗，5人死亡，据报道暴发流行是由Walkerton区的供水系统受到污染引起的。世界各地，肠出血型大肠埃希菌0157：H7的暴发与流行仍时

4、有发生，发病呈上升趋势，由于病情凶险，病死率高(HUS死亡率90％以上)，已引起各国政府及医疗卫生、科研机构的高度重视。EHEC0157：H7的致病机制目前尚不十分清楚，其主要致病基因有志贺样毒素基因(stx)、大毒力质粒p0157和染色体肠细胞脱落位点LEE(thelocusofenterocyteeffacement，LEE)致病岛等。EHEC0157：H7感染引起的典型病理特中文摘要征是肠上皮细胞黏附．抹去(attachingandeffacing，A／E)损伤。目前研究认为，引起黏附．抹去(attachinga

5、ndeffacing，A／E)损伤的毒力因子大多位于其LEE致病岛，效应蛋白多达20多种，其中效应蛋白EspF的作用范围最大，是多功能性的。EspF蛋白可以突破肠上皮屏障，定位于宿主细胞的线粒体，启动线粒体途径的凋亡，且EspF的N端是线粒体靶向信号(mitochondrialtargetingsignal，MTS)功能区，因为将MTS区缺失突变，EspF蛋白靶向结合于宿主线粒体的功能消失。利用谷氨酸代替EspF的第16位亮氨酸，EspF靶向结合于宿主细胞线粒体的功能完全消失，因此认为MTS的第16位亮氨酸是EspF蛋

6、白重要的功能部位。EspF蛋白迁移到宿主细胞线粒体后，与线粒体靶向结合，启动细胞线粒体途径的凋亡：引起线粒体膜通透性改变，进而导致细胞线粒体膜电位降低，细胞色素C从线粒体释放到细胞浆，引起Caspase家族蛋白酶．9和Caspase家族蛋白酶．3的裂解。感染后期EspF在核仁聚集，并且这一过程受线粒体调控，这种机制的阐明将为细菌蛋白在宿主细胞的时空调控机制揭开新的篇章。近来，一些研究发现EspF可以通过SH3和EVHl结构域分别与宿主蛋白SNX9(sortingnexin9)和Wiskott—Aldrich综合征蛋白(

7、Wisko小Aldrichsyndromeprotein，WASP)结合，认为EspF集合SNX9和WASP，形成新的信号模仿物，导致上皮细胞紧密连接破坏、微绒毛消失、细胞骨架重排、肌动蛋白聚集、垫状结构(pedestal)形成，最后引起细胞程序性凋亡，这在A／E损伤中起主要作用。学术界，效应蛋白EspF被认为是病原细菌致病的瑞士军刀，对于研究EHEC致病的分子机制至关重要。尽管近些年对EspF有了更深一步的研究，证实EspF可以突破肠上皮屏障，降低宿主细胞的跨膜电阻，破坏肠屏障功能，参与破坏肠上皮细胞紧密连接，但Es

8、pF蛋白诱导宿主细胞死亡的机制仍然不是很清楚。那么EHEC0157：H7的EspF蛋白，是否对细菌的黏附性、在宿主细胞的定位及对线粒体途径的凋亡都有影响呢?本实验的前期研究中，我们采用重叠延伸PCR(OL．PCR)和同源重组技术，已成功构建了espF基因缺失突变株EHEC0157：H7(Aespb-)，该突变株表达的EspF蛋白N