肝细胞分泌的hmgb1蛋白的分离、纯化、鉴定及对小鼠巨噬细胞的作用

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1、中南大学博士学位论文肝细胞分泌的HMGB1蛋白的分离、纯化、鉴定及对小鼠巨噬细胞的作用姓名：萧梅芳申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：范学工20120519博士学位论文中文摘要肝细胞分泌的HMGBl蛋白的分离、纯化、鉴定及对小鼠巨噬细胞的作用中文摘要目的：(1)分离、纯化肝细胞系HepG2细胞分泌的高迁移率族蛋白1(highmobilitygroupbox一1protein，HMGB1)，并加以鉴定。(2)探讨HMGBl在体外对巨噬细胞RAW264．7增殖、释放乳酸脱氢酶(1actateDehydrogenase，LDH)、凋亡以及分泌肿瘤坏

2、死因子一仅(tumornecrosisfactor-a，TNF—a)、白介素一lp(interleukin-lbeta，IL一1p)和白介素．6(IL一6)的作用。．方法：(1)分别培养人肝细胞系HepG2细胞与免疫细胞系U937细胞，采用400ng／mL的脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)刺激20h后收集细胞培养液上清。依次采用超滤浓缩、阳离子交换层析(CM—Sepharosecationexchangechromatography)、阴离子交换层(DEAE—Sepharosecationexchangechromatogr

3、aphy)、SephadexG75凝胶过滤层析(SephadexG75-gelfiltrationchromatography)，结合免疫沉淀的方法，进行分离纯化。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)及western印迹法进行蛋白分子质量及性质鉴定。(2)体外经不同浓度的HMGBl(10，50，lOOng／mL)刺激24h，并以本课题受以下项目资助：1)国家自然科学基金面上项目(30972621)2)湖南省自然科学基金(1lJJ4074)3)湖南省科技厅计划项目(201lTT2060)4)中南大学大学生创新实验计划(YDl0145)5)中南

4、大学湘雅医学院优秀博士生选题计划资助博士学位论文中文摘要100ng／mL于不同时间点(8h，24h，48h)刺激巨噬细胞RAW264．7，采用MMT法检测巨噬细胞的增殖，收集培养上清，测定上清中的LDH含量。(3)体外经不同浓度的HMGBl(10，50，100ng／mL)刺激24h，或以100ng／mL的HMGB1作用不同时间(8h，24h，48h)后，采用TUNEL法检测巨噬细胞凋亡的情况。(4)体外经不同浓度的HMGBl(10，50，100rig／mL)刺激24h，或以100ng／mL作用不同时间(8h，24h，48h)，采用酶联免疫吸附法(

5、ELISA)测定细胞培养上清液中TNF．仅、IL．1p以及IL．6水平的变化。结果：(1)从2株细胞培养上清分离纯化得到的蛋白经SDS．PAGE鉴定，其纯度达90％以上，分子质量约为26kD，Westem印迹法鉴定为HMGBl蛋白。(2)MTT结果显示，HMGB1不同剂量(10，50，100ng／mL)组以及100ng／mLHMGBl作用不同时间点(8h，24h，48h)，巨噬细胞的增殖能力均明显低于巨噬细胞空白对照组(P

6、用不同时间点(8h，24h，48h)，巨噬细胞释放LDH的量均明显高于巨噬细胞空白对照组(P<0．05)。(4)经不同浓度的HMGBl刺激24h，其中lOOng／mL组HMGB1诱导巨噬细胞凋亡效应最强，与对照组比较有显著性差异(P

7、应关系。采用100ng／mL的HMGBl作用不同时间后，培养上清液中TNF．0c，IL一113和IL一6的表达水平在48h达高峰(P

8、icationofHMGBlsecretedbylivercelllinesanditsbiologicalactivityAbstra