大肠杆菌k88、k99广谱噬菌体的分离与生物学特性鉴定

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1、华中农业大学硕士学位论文大肠杆菌K88、K99广谱噬菌体的分离与生物学特性鉴定姓名：何觅之申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：龙良启201206大肠杆菌K88、K99广谱噬菌体的分离与生物学特性鉴定摘要自从大肠杆菌第一次被人们发现以来，致病大肠杆菌在全球范围内给养殖业造成了严重的损失。在大肠杆菌众多的血清型中，尤以E．coliK88、E．coliK99最为广泛，到目前为止尚无有效的措施和药物预防和控制。噬菌体作为一种细菌病毒，能对宿主菌进行特异裂解，这一特性使得研究者找到了治疗细菌性问题的新思路和新方法。近来相关研究表明：治疗性噬菌体制剂拥有使用剂量小、疗效好、无毒副作用、疗效快

2、等抗生素无法比拟的优点。美国FDA在2007年批准上市的大肠杆菌0157：H7噬菌体制剂，标志着噬菌体制剂研究的进入了临床研究的新阶段。本试验采用双层琼脂平板法来进行噬菌体的分离和纯化，并且以E．coliK88为宿主菌，分离到1株烈性噬菌体，将其命名为Bp8A081l；以E．coliK99为宿主菌分离得到2株烈性噬菌体，分别将其命名为Bp981226、Bp9C1213。其中2株E．coliK99噬菌体的效价较高，可以达到1010pfu／ml，Bp8A0811的效价与Bp981226、Bp9C1213的效价为109pfu／ml。刚开始分离得到的噬菌斑较小，经进一步的纯化后，其噬菌斑明显增大

3、，对宿主菌的裂解能力增强。通过3株噬菌体对E．coliK88、E．coliK99及鸡大肠杆菌的裂解谱和裂解曲线的测定，发现Bp8A0811基本不能裂解E．coliK99、鸡大肠杆菌，其对这两种细菌的裂解曲线与对照组曲线相差不大。Bp981226、Bp9C1213对E．coIiK99的裂解曲线除了在刚开始的时候有一点上升，很快就会下降；Bp981226、Bp9C1213对E．coliK88的裂解曲线在上升段的时间比E．coliK99上升段的时间长，其裂解E．coliK88的能力较Bp8A0811弱。3株噬菌体都不能裂解鸡大肠杆菌，且噬菌体与细菌的混合液的OD600值一直呈上升的趋势。通过对

4、Bp981226噬菌体生物学特性研究发现，其热稳定性较好，在60℃水浴作用30min仍有较高的效价；但其对温度耐受性不高，当水浴时间延长至60min后，其效价下降较多。Bp981226噬菌体在pH6．9范围内效价较稳定，在pH小于5和pH大于10时，其效价明显下降。本实验研究探讨了4种不同的保存方法，发现噬菌体在4‘C和．80。C保存的效果较好，其效价在6个月内仅下降2．3个数量级，这两种保存方法适合用于6个月内的保存；常温和．20℃都不能长期保存，超过3个月的保存时间，效价受到较大的影响。关键词：大肠杆菌K88、K99；噬菌体；生物学特性华中农业大学2012届硕士学位论文Abstrac

5、tThepathogenicE．colihasresultedinseriouslossestotheaquacultureindustryintheworldsincetheE．coliwasfirstdiscovered．TheEcoliK88andK99arethemostwidelyserotypesinalargenumberofEcoli．andthereisnoeffectivedrugtopreventandcontrolthemuntilnow．Phage，abacteriaviruses，Canspecificlysisofthehostbacteria，andthi

6、sfeatureallowsresearcherstofindnewideasandmethodsforthetreatmentofbacterial．Recentresearchshowsthattherapeuticphagepreparationshavetheantibioticsincomparableadvantages，suchasasmalldosage，efficacy,toxicside，fasteffectandSOon．In2007，theU．S．FDAapprovedthefirstphagepreparationsforEcoli0157：H7，whichma

7、rksthatthephagepreparationsenteredanewstageofclinicalresearch．Inthistest，double—layeragarplateWaSusedtoseparateandpurificatephage，andwehasisolatedastrong·lysisE．coliK88phagenamedasBp8A081andtwostrong—lysisE．coliK99phag