副溶血弧菌感染斑马鱼的致病性及天然免疫应答研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M090104226上海海洋大学硕士学位论文副溶血弧菌感染斑马鱼的致病性及题目：天然免疫应答研究Pathogenicityandinnateimmune英文题目：responsetoVibrioparahaemolyticusinfectioninthezebrafish专业：临床兽医学研究领域：水产动物医学姓名：张永华指导教师：张庆华副教授二O一二年五月十七日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和

2、引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签

3、名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注房文红东海水产研究所研究员主席杨先乐上海海洋大学教授委员陆宏达上海海洋大学教授委员张庆华上海海洋大学副教授委员胡鲲上海海洋大学副教授秘书答辩地点病原库答辩日期2012.5.16上海海洋大学硕士学位论文副溶血弧菌感染斑马鱼的致病性及天然免疫应答研究摘要近年来随着水产养殖业的发展，水产动物病害问题也日益突出，副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus,Vp)是引起多种海水鱼类产生弧菌病的主要病原菌之一。由于水产动物重大病害频频发生给水产养殖业

4、造成灾难性的危害，使得免疫防治技术在鱼病防治中呈现出日益广阔的应用前景。因此，对鱼类免疫机制的研究受到国内外学者的广泛关注，且尤为重视天然免疫应答机制的研究。斑马鱼(Daniorerio)拥有完整的免疫系统（特异和天然免疫系统），而且体型小，生命周期相对较短，易于实验室养殖，便于开展大规模的试验。斑马鱼是研究鱼类传染病的发病机理和免疫应答等基础研究的最合适的模型动物。本研究用副溶血弧菌的鱼类致病株(Vp1.2164)和人类致病株(Vp17)为研究对象，以斑马鱼为感染动物模型，探讨参与天然免疫应答的炎性细胞因子的变化规律。首先，系统比较了不同保藏方法对副溶

5、血弧菌的毒力及生物学特性的保藏效果，为进行后续的相关研究提供了先决条件；其次，摸索其感染斑马鱼的有效方式及其致病性，分析了不同感染方式下致病菌株对斑马鱼的致病性；最后，采用荧光定量PCR技术检测了斑马鱼在创伤感染和腹腔注射副溶血弧菌后，比较了2株副溶血弧菌创伤感染和腹腔注射感染斑马鱼后，IL-1β、IFN和TNF这3种炎性细胞因子的表达变化，得到以下主要结论：1、本研究发现不同保藏方法，副溶血弧菌随保藏时间的延长毒力有不同程度的下降。短期保藏，室温斜面保藏比4℃斜面保藏效果好；长期保藏，-80℃甘油保藏和冷冻真空干燥保藏效果较好，均为24个月以上；在-2

6、0℃，保护剂脱脂牛奶比甘油的效果要好，而在-80℃甘油保藏效果很好，说明甘油在超低温下作为保护剂更适合副溶血弧菌。2、本研究发现鱼类致病株（Vp1.2164）与人类致病株(Vp17)对野生斑马鱼的毒力差异不显著，两者均出现典型的败血症症状，可在死亡鱼的体内再分离到副溶血弧菌。组织病理切片显示肠粘膜上皮细胞脱落、炎性水肿，脾脏充血，水肿。斑马鱼在肌肉注射、腹腔注射感染或者创伤皮肤后浸泡下易感染副溶血弧菌，单纯的浸泡不会被感染。相比而言，腹腔注射较易操作，是较优的感染途径。I上海海洋大学硕士学位论文3、本研究用鱼类致病株（Vp1.2164）与人类致病株(Vp

7、17)分别创伤感染和腹腔注射感染斑马鱼，利用荧光定量PCR技术检测IL-1β、IFN和TNF三种炎性细胞因子的mRNA转录水平变化。结果表明：与对照相比，2株细菌不同感染条件下斑马鱼3种基因的表达量随着感染时间延长均呈现出先升高后降低的变化特点。创伤感染Vp1.2164和Vp17的斑马鱼在8h，IL-1β表达水平达到高峰，分别为对照组的125.7和100.9倍；TNF的表达水平也在8h达到高峰，分别为对照组的249和55倍；而IFN的表达量达最大值的时间在2株菌中出现差异，创伤感染Vp1.2164的斑马鱼在8h，约为对照组的11.6倍，而感染Vp17的斑

8、马鱼在4小时，为对照组的10.4倍。腹腔注射感染Vp1.2164和Vp17斑马鱼