与内质网应激相关microrna的筛选及其靶标的验证

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1、华中农业大学硕士学位论文与内质网应激相关microRNA的筛选及其靶标的验证姓名：徐鹏申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：肖少波201206与内质网应激相关microRNA的筛选及其靶标的验证摘要真核细胞中大约三分之一的蛋白质进入内质网中完成折叠和一些加工过程。当进入内质网中的蛋白质超过了内质网功能的承载能力，就会激活未折叠蛋白质反应(unfoldedproteinresponse，UPR)的信号转导过程，来协调内质网的加工能力和进入内质网的蛋白质量。内质网应激和许多疾病状态相关，如代谢性疾病、心血管疾病和神经衰退性疾病。MicroRNA是一种内源性的22个

2、碱基左右大小的RNA分子，主要通过和mRNA的3端非翻译区的非完全互补性结合，抑制mRNA的翻译过程。MicroRNA参与多种细胞应激反应，其中的一些应激反应也影响到内质网的功能，如缺氧、胰岛素分泌和B细胞分化过程。本研究试图发现参与内质网应激过程的MicroRNA，并进一步探讨这些MicroRNA在内质网应激中的生物学功能。进行了以下研究：1．基因芯片筛选与内质网应激相关mieroRNA内质网应激刺激物衣霉素(Tm)处理HEK293细胞，8h收取样品，用microRNA基因芯片筛选表达量发生变化的microRNA。结果发现有4种microRNA的表达量发生变化，其

3、中miR．26a表达量下调，miR．148a，miR-181b和miR．30d表达量上调，但变化的幅度都不大。2．建立实时定量RT-PCR检测mieroRNA的方法，验证基因芯片结果建立实时定量RT-PCR检钡lJmicroRNA的方法，并通过检测扩增标准曲线斜率和产物熔解曲线验证了这种方法的可靠性。Tm处理HEK293细胞，24h内选择多个时间点实时定量RT-PCR检钡lJmiR．26a，miR一148a，miR．181b和miR．30d的表达量，结果只发现miR．148a在内质网应激的过程中表达量显著上调，至1]24h时上调达到2倍。用不同浓度Tm刺激HEK29

4、3细胞，实时定量RT-PCR检钡JJmiR-148a表达量，发现miR-148a上调程度和内质网应激的程度正相关。3．miR．148a调控UPR相关基因PDIA3和CNX用microRNA靶标预测软件预测miR．148a可能调控的UPR相关基因，包括GRP78、GRP94、HRDl、OS9、EDEMl、PDIA3和CNX七个基因。分别构建这几个基因的3’UTR双荧光素酶报告质粒。共转染实验显示miR．148a的模拟物可以显著抑制PDIA3和CNX报告质粒的相对荧光值，而miR一148a的抑制剂可以上调PDIA3和CNX报告质粒的相对荧光值。构建PDIA33’UTR与

5、miR。148a相互作用的种子序列突变的报告质粒，共转染实验证实突变后消除了miR．148a模拟物的抑制作用。说明miR-148a调控UPR相关基因PDIA3和CNX。4．miR-148a、PDIA3和CNX在内质网应激过程中的变化关系Tm刺激HEK293细胞24h，实时定量RT-PCR检测miR．148a、PDIA3和CNX表达一．一堡主奎些奎堂!旦!三旦堡主堂焦笙茎—————————————————————————__-__-___-—_●-I——____—____—————————————————————一一量变化，绘制表达量的动力学曲线。结果显示在内质网应激

6、过程中，3种基因的表达均缓慢上调，PDIA3的转录首先被激活，并且上调幅度一直比miR·148a1搞，而CNX与miR-148a的变化幅度相近。关键词：内质网应激；miR-148a；PDIA3；CNX2与内质网应激相关microRNA的筛选及其靶标的验证AbstractApproximatelyonethirdofproteinsineukaryoticcellsenterEndoplasmicreticulumlumentocompletetheirfoldingprocessandundergosomeposttranslationalmodifications

7、。Iftheinfluxofnascent，unfoldedpolypeptidesexceedsthefoldingand／orprocessingcapacityoftheER，thenormalphysiologicalstateoftheERisperturbed，signalingpathways，termedtheunfoldedproteinresponse(UPR)，areactivatedtoadjustthebalancebetweentheefficiencyandfidelityofproteinfoldingandERproteinlo