营养诱导舍饲绵羊非繁殖季节发情相关microrna筛选及其靶基因功能验证

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1、I分类号：密级：学号：2012103025单位代码：10759石河子大学硕士学位论文营养诱导舍饲绵羊非繁殖季节发情相关microRNA筛选及其靶基因功能验证学位申请人林杉指导教师赵宗胜教授申请学位门类级别理学硕士学科、专业名称遗传学研究方向动物遗传与基因组学所在学院生命科学学院中国·新疆·石河子2015年6月IIThemicroRNAselectionandtargetgenefunctionidentifycontrolledbynutritionlevelofestrousstall-feedsheepinnon-breedingseasonADissertationSu

2、bmittedtoShiheziUniversityInFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofNaturalScienceByLinShan(Genetics)DissertationSupervisor:Prof.ZhaoZong-shengJune,2015IIIIV摘要绵羊是典型的季节性发情动物，其发情的季节性特点一直是制约绵羊生产繁殖效率的瓶颈。目前，针对绵羊季节性发情调控机制的研究主要集中在光通路调控方面，现普遍认为绵羊的季节性发情主要受光通路的调控，并初步确定了其繁殖活动的光通路季节性发情调控模式图。但

3、在实际生产中发现，除了日照、温度等因素影响绵羊的季节性发情外，高营养水平饲喂的哈萨克羊在非繁殖(乏情）季节也可以表现出发情的现象，研究这一营养水平的改变如何调控非繁殖季节绵羊发情活动，对提高绵羊生产繁殖效率具有重要的指导意义；为此本研究开展了营养诱导舍饲绵羊在非繁殖季节条件下，发情相关microRNA筛选及其靶基因功能验证实验，具体内容如下：目的：在不同营养水平处理绵羊中，通过筛选差异表达的microRNA，用生物信息学分析方法推测其靶基因，分析靶基因在光通路或其它通路的作用，建立营养调控发情的信号通路。方法：（1）构建不同营养水平哈萨克羊群，在乏情期对试验绵羊发情情况观察记

4、录。（2）乏情季节，前后分别屠宰3只发情(EN)和乏情母羊(AN)，分别采集下丘脑(H)、垂体(P)和卵巢(O)，共构建6个miRNA文库，并进行生物信息学分析。通过实时荧光定量PCR检测部分miRNA相对表达量，验证建库的可靠性。对差异表达中出现频率较高的miR-200a/b/c进行组织表达谱分析。（3）细胞水平验证实验。通过双荧光素酶报告基因系统，验证miR-200b对靶基因GNAQ的真实干扰作用。miR-200b干扰载体转染下丘脑神经细胞，选择GNAQ下游基因ITPR,PRKCB,GNA1,CREB,MAP3K1,GPR54,KISS1及GnRH进行实时荧光定量检测

5、。miR-200b干扰载体转染卵巢颗粒细胞，选择GNAQ下游基因COMT,HSD3B1,CYP1A1和PKA基因进行表达量验证。结果：（1）高营养实验组发情率明显高于对照组。（2）下丘脑（HENvsHAN）两文库相比，有8个已知和140个未知miRNA表达差异显著。垂体（PENvsPAN）两文库相比，有14个已知和104个未知miRNA表达差异显著。卵巢（OENvsOAN）两文库比较发现，有9个已知和104个未知miRNA表达差异显著。通过软件预测出靶基因并进行GO分析发现，以上文库涉及细胞过程、发育过程、生长过程、代谢过程、生物调节过程、细胞融合、催化活性、繁殖过程

6、和酶调节活性过程等。对其调控通路进行KEGG分析，发现有MAPK信号通路(钟基因相关通路)，GnRH信号通路（发情激素相关），胰岛素信号通路，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢和甘油磷脂代谢通路等。通过部分miRNA的实时荧光定量PCR结果验证了建库的可靠性。对哈萨克羊miR-200a/b/c进行组织表达谱分析，结果发现miR-200a/b/c在生殖系统垂体、子宫和输卵管中表达量较高。（3）以荧光素酶表达结果显示：共转染GNAQ-3’UTR-psi-CHECKTM-2和pri-miR-200b-pcDNA3.1(+)的hela细胞组是只转染psi-CHECKTM-2的hela细胞组

7、荧光素酶值的77.5%；其余两组与只转染psiCHECKTM-2的hela细胞组之间的差异没有统计学意义。下丘脑细胞转染实验结果发现，miR-200b干扰组和对照组相比，GNAQ基因显著下调，下游ITPR,PRKCB,GNA1和MAP3K1，发情关键基因GPR54,KISS1和GnRH显著上调。卵巢颗粒细胞转染结果发现，miR-200b干扰后，GNAQ基因表达量升高，下游基因COMT,HSD3B1,CYP1A1和PKA表达量下降。结论：（1）通过靶基因及相关发情通路分析，总结出从酪氨酸和叶酸两种营养