肺腺癌吉非替尼获得性耐药相关microrna筛选及其功能初步的研究

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1、天津医科大学硕士学位论文中文摘要背景与目的：肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在世界各国均呈明显上升趋势，更由于其难于早期发现、诊断和治疗，严重的威胁人类健康。目前肺癌的主要治疗手段仍是手术、化疗和放疗，总体疗效并不如人意。尤其对于一些晚期肺癌患者，因失去手术机会往往需要大剂量的化疗来延长生存期，而化疗药显著的毒副作用也是患者备受痛苦。作为一种新型的分子靶向治疗药物，吉非替尼可以抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶活性，在临床应用中，不论单用还是与化疗药物联合使用都表现了较强的作用，延长了患者的生存时间，改善了患者的生存质量，但几乎所有的用

2、药患者最终都会产生耐药，限制了其长期疗效。目前研究认为吉非替尼耐药的产生可能是多种机制共同作用的结果，有研究表明，microRNA的调控作用可能参与了肿瘤的吉非替尼获得性耐药过程。microRNA是一类非编码的内源性小RNA分子，通常由20．22个核苷酸组成，广泛存在于各种生物体中，在转录后水平负性调控基因的表达。人们研究相继发现microRNA参与人体多种生命活动，可促进细胞增殖，对细胞的凋亡通路进行调节，参与细胞周期的调控，参与人体的代谢过程等。肿瘤发生与细胞的异常增殖、分化及凋亡密切相关，通过这些癌症相关途径发现了一些与肿瘤相关的microRNA

3、，例如miR．126、miR．14等。在microRNA调节耐药基因的相关研究中，发现miR．27a和miR-451与P．糖蛋白表达和MDRI基因产物的活化相关，可导致肿瘤细胞产生耐药性。microRNA也参与了吉非替尼获得性耐药的产生。有研究发现mir-128b可以靶向EGFR，在多例非小细胞肺癌肿瘤标本中可以检测到mir-128b的杂合性缺失，并且mir-128b的杂合缺失与吉非替尼用药后的临床效果及生存显著相关。在肺癌细胞中过表达let．7a、miR．126、miR-45能够控制住AKT和ERK活性，并增加肺癌细胞对吉非替尼的敏感度，转染mir-

4、126后可使肺癌细胞的耐药指数增加6倍。目前国内外关于microRNA在肿瘤的吉非替尼获得性耐药机制中的作用的研究很较少，因此对microRNA在肺癌吉非替尼的获得性耐药机制中的作用做进一步的研究，对于肿瘤临床个体化方案的选择、避免和克服吉非替尼获得性耐药具有重大意义。肺癌对吉非替尼产生耐药性是临床常见问题，困扰着肺癌的治疗。本研究旨在在分析和鉴定对吉非替尼敏感和耐药的人肺腺癌细胞株耐药性差异的基础上，建立对吉非替尼敏感和耐药的人肺腺癌细胞株的microRNA表达谱，从中筛天津医科大学硕十学位论文选出与人肺腺癌细胞吉非替尼耐药密切相关microRNA，

5、为深入研究人肺癌吉非替尼敏感和抗性的分子标志物、指导肺癌的“个体化"治疗方案奠定基础。方法：本研究以Gefitinib高度敏感的PC9细胞以及由PC9细胞经过MNNG诱变筛选得到的具有不同吉非替尼IC50的三株耐药细胞株PC9／AB2、PC9／ABll、PC9／BB4为研究对象，通过倒置显微镜观察四株细胞的形态学差异、细胞计数法绘制细胞生长曲线并计算细胞倍增时间、流式细胞术检测四株细胞的周期分布、MTT法检测吉非替尼对四株细胞的IC50等方法，鉴定敏感株PC9细胞与三株耐药细胞间的生物学特性和耐药性的差异，以及三株耐药株之间的生物学特性和耐药性的差异，

6、在此基础上进一步应用microRNA表达谱芯片技术，筛选鉴定与人肺腺癌细胞吉非替尼耐药相关的差异microRNA表达谱。构建与吉非替尼获得性耐药相关的microRNA表达载体及对照载体，转染耐药细胞株，筛选与获得性耐药产生机制相关的microRNA。结果：1．耐药细胞株PC9／AB2、PC9／ABIl、PC9／BB4与敏感细胞株PC9相比，PC9／BB4细胞形态变化较明显，胞体细长：与敏感株PC9细胞相比，PC9／ABI1在G0／Gl期的分布显著高于PC9(P=0．009)，PC9／AB2、PC9／BB4在G0／G1期的分布显著低于PC9细胞(P均为0

7、)；PC9／ABll细胞在G2／M期的分布与PC9细胞无显著差异，PC9／BB4细胞在G2／M期的分布显著低于PC9细胞(P=o．031)，PC9／ABll细胞在G2／M期的分布显著低于PC9细胞(P=O)；PC9／ABll细胞在S期的分布显著低于PC9细胞(P=0．003)，PC9／BB4细胞在S期的分布显著高于PC9细胞(P=0)，PC9／ABll细胞在S的分布显著高于PC9细胞(P=O)；细胞的倍增时间有显著延长；2．MTT法检测细胞的IC50，敏感株PC9细胞的ICs)是(O．022±0．01)gmol／L、耐药株PC9细胞的IC50／ABll

8、是(2．07±O．11)I上mol／L、PC9／BB4细胞的ICso是(O．973±O．176