trail耐药的kasumi-1细胞株的建立及mrna表达谱差异分析

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1、复旦大学硕士学位论文TRAIL耐药的Kasumi-1细胞株的建立及mRNA表达谱差异分析EstablishmentofTRAIL-ResistantKasumi-1CellLineandAnalysisofmRNAExpressionProfileDifferences院系：上海市第五人民医院专业：内科学姓名：蒋雪玮指导教师：刘立根教授完成日期:2012年04月22日目录觀1、‘-_i_--刖55第一部分TRAIL耐药的Kasumi-1细胞株的建立61、材料和方法62、实验结果123、娜214、舰21第二部分基因芯片检测细胞mRNA表达谱差异

2、221、材料和方法222、实验结果283、辦324、舰32综述白血病与TRAIL耐药研宄进展37gfilt45播面彌安研究背景：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand,TRAIL)对人类白血病细胞有杀伤作用，而不损伤正常细胞，但其普遍耐药也限制了它的应用。体外对重组可溶性TRAIL(recombinantsolubleTRAIL,rsTRAIL)诱导急性髓系白血病伴t(8;21)细胞株Kasumi-1凋亡的研究发现，rsTRAIL到达一定浓度后，Kasumi-1细胞株

3、的存活率不再有明显下降，提示Kasumi-1细胞株对TRAIL存在一定的耐药性。第一部分TRAIL耐药的Kasumi-1细胞株的建立目的：建立TRAIL耐药的Kasumi-1细胞株，测定计算耐药相关指标。比较亲本株和耐药株的形态、分子生物学及TRAIL和受体的表达。方法：1)逐步递增培养液中rsTRAIL的浓度，使其间歇作用于Kasumi-1细胞，通过体外诱导筛选得到耐药株Kasumi-1R(Kasumi-1resistantcellline,Kasumi-1R)；2)采用CCK-8比色法，分别测定Kasumi-1和Kasumi-1R的生长曲线，以及加入不同浓度的rsTRAIL

4、后24h、48h的生长曲线，计算两种细胞的IC50、耐药指数(ResistanceIndex,RI)；3)瑞氏染色显微镜下观察两种细胞及用药后的形态；4)AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡；5)RT-PCR检测细胞AML1-ET0融合基因、ETO外显子9a、TRAIL的三个异构体及TRAIL受体1-4的mRNA表达；6)流式细胞术检测细胞表面TRAIL和TRAIL受体1-4的表达。结果：l)Kasumi-lR细胞增殖较Kasumi-1细胞快；2)Kasumi-1细胞24小时IC50为756.833ng/ml(logIC50为2.879±0.148)，Ka

5、sumi-1R细胞24小时IC50为1634646.005ng/ml(logIC50为6.213±0.637)，Kasumi-1R细胞24小时耐药系数RI为2159；Kasumi-1细胞48小时IC50为345.390ng/ml(logIC50为2.538±0.153),Kasumi-1R细胞48小时IC50为33642.641ng/ml(logIC50为4.257士0.317),Kasumi-1R细胞48小时耐药系数RI为97;3)相同浓度rsTRAIL作用两株细胞后，Kasumi-1R细胞凋亡率低于Kasumi-1细胞；4)Kasumi-1细胞和Kasumi-1R细胞AML

6、1-ETO融合基因、ETO外显子9a和TRAIL的三个异构体及其受体1-4mRNA均有表达；5)Kasumi-1细胞和Kasumi-1R细胞表面TRAIL和TRAIL受体1-4的表达没有差别。结论：Kasumi-1R对rsTRAIL高度耐药。第二部分基因芯片检测细胞mRNA表达谱差异目的：比较Kasumi-1细胞和Kasumi-1R细胞mRNA表达谱差异，筛选耐药相关基因。方法：用AffymetrixHumanGenomeU133Plus2.0Array分别做Kasumi-1细胞（3个生物学重复）和Kasumi-1R细胞（3个生物学重复）的mRNA表达谱分析，找出表达差异基因。

7、用GO功能注释分析、Pathway富集度分析等数据处理找寻与TRAIL耐药可能相关的基因。结果：与Kasumi-1细胞相比，Kasumi-1R细胞表达上调大于2倍的基因有1537个，表达下调大于2倍的基因有487个。其中BCL-2家族的抑凋亡基因BCL2上调3.153倍，BCL2A1上调18.23倍，参与JAK/STAT通路的IFNAR1上调12.841倍，TRAIL的死亡受体TNFRSHOA表达下调3.256倍。结论：Kasum-1RTRAIL耐药可能与BCL2、BCL2A1和IFNAR1