rpl8基因修饰的dc疫苗抑制胶质瘤生长的研究

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1、遵义医学院硕士学位论文RPL8基因修饰的DC疫苗抑制胶质瘤生长的研究姓名：谈艳芳申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：黄俊琼201205遵义医学院硕士学位论文RPL8基因修饰的DC疫苗抑制胶质瘤生长的研究摘要实验目的：1构建RPL8基因的重组腺病毒载体和空载体腺病毒，获得高滴度的腺病毒颗粒。2将RPL8腺病毒颗粒体外转染小鼠树突状细胞(DC)，制成表达RPL8的DC疫苗。3采用MTT比色法检测RPL8基因修饰的DC疫苗刺激同种T淋巴细胞对GL261胶质瘤细胞特异的杀伤率。4将RPL8基因修饰的DC疫苗注入荷瘤小鼠体内，观察疫苗刺激小鼠产生的抗肿瘤作用。实验方法：1大量培养胶质瘤细胞，按

2、照总RNA试剂盒提取细胞RNA，以总RNA为模板，用RT-PCR方法克隆目的基因RPL8，与载体连接、酶切、插入，并转移到pAdxsi腺病毒骨架载体上，包装扩增成腺病毒颗粒。2用重组腺病毒(pAdxsi—EGFP-I冲L8)及空病毒Ad．EGFP(作为阴性对照)以实验室最佳的感染复数(MOI)15()感染小鼠树突状细胞，于感染后24h、48h，在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况，并应用RT-PCR方法检测DC中有无RPL8mRNA的表达。3重组RPL8的病毒颗粒(及空病毒)转染DC，培养48h后与尼龙毛柱分离的小鼠脾脏T淋巴细胞按不同的比例混匀，继续培养72h，分别

3、以不同效靶比加入到GL261胶质瘤细胞中培养48h，酶标仪测定其OD值。4将RPL8基因修饰的DC疫苗注入荷瘤小鼠体内，进行免疫治疗的体内实验，观察肿瘤的体积变化及小鼠的生存时间与瘤体组织的病理变化。结果：1经酶切及测序鉴定，成功构建了携带RPL8基因的重组腺病毒载体，并制各出高滴度(1．6×1010PFU／m1)的重组腺病毒和空载体腺病毒(1．0×1010PFU／m1)。2不同时间在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白(EGFP)表达，并用RT—PCR的方法检测出DC细胞中有RPLSmRNA的表达，得到预期309bp的条带。3RPL8基因修饰的DC疫苗体外杀伤GL261胶质瘤细胞的细胞毒活

4、性与空载病毒组及遵义医学院硕士学位论文RPL8基因修饰的DC疫苗抑制胶质瘤生长的研究PBS组比较，差异有显著性(p0．0,5)。4RPL8基因修饰的DC疫苗，注入荷瘤小鼠体内后，疫苗组的小鼠生存期与小鼠的肿瘤体积变化较空载组及对照组有显著性差异(p<0．05)。结论：RPL8基因修饰的DC疫苗对胶质瘤小鼠具有免疫治疗作用，为免疫治疗胶质瘤提供理论依据。关键词：腺病毒载体；RPL8；树突状细胞；胶质瘤；免疫治疗遵义医学院硕士学位论文RPL8基因修饰的DC疫苗抑制胶质瘤生长的研究Experimentalstudyoftheanti-g

5、liomaseffectsofdendriticcellsObjective：loadedRPL8vaccineAbstract1ToconstructtherecombinantadenovirusvectorencodingmouseRPL8geneandhightiteradenovirusparticlesyielded．2TheRPL8recombinantadenovirusviralparticlestransfectintoDCtoproduceDCVaCClne．3ItisMTTmethodtestcarrierRPL8DCvaccineagainstGL261glio

6、mascellsspecificCTL．4RPL8adenovirusinanmousemodelofgliomaandtodiscussthefeasibilityofthisactiveimmunotherapystrategyforglioma．Methods：1RPL8CDNAwasclonedintoadenovirustransfervectorpshuttle·-EGFP··CMV(--)TEMPandanalyzedbyrestrictionenduceleaseEcoRIandHinddigestion．Thentheobtainedplasmidpshuttle-EG

7、FP—CMV(一)TEMP-RPL8wastransferredintopAdxsibackbonevectortoconstructAdxsi-GFP·RPL8plasmid，andwasidentifiedbyXholdigestion．Thecorrectrecombinantadenovirusplasmidwasinfectedinto293celllineswithliposome．2MouseDCinfectedwit