mapk信号通路与肝癌耐药的关系及下调erk1erk2逆转肝癌细胞耐药性的研究

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1、厦门大学硕士学位论文MAPK信号通路与肝癌耐药的关系及下调ERK1/ERK2逆转肝癌细胞耐药性的研究姓名：阮文雯申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：潘超201205摘要目的：1．用组织芯片和免疫组化技术检测肝癌组织中MAPK相关蛋白及多药耐药蛋白的表达，检测MAPK与肝癌多药耐药的关系。2．用组织芯片检测MAPK相关蛋白、多药耐药蛋白及增殖指标的表达，分析其与临床特点及预后的关系，探索其指标是对肝癌病人的临床意义。3．化疗药物诱导建立多株人肝癌多药耐药模型，鉴定其耐药性，比较亲本株与耐药株生物学特点的差异。4．用索拉菲尼及EIⅨ抑制剂PD98059下调EIⅨ后检测人肝癌细胞耐

2、药株耐药性的变化，探索耐药细胞耐药性与ERK的关系。方法：1．制作组织芯片，免疫组化检测MAPK相关蛋白、多药耐药蛋白及增殖指标的表达。对获得的大样本的数据进行统计学分析，分析MAPK相关蛋白和多药耐药相关蛋白之间的相关性，及多药耐药蛋白与增殖指标之间的相关性。2．采用ADM对SMMC．772l、BEL．7402等二株人肝癌细胞株进行大剂量冲击诱导。用显微镜观察细胞在诱导过程中的生物形态变化。采用MTT法进行药敏实验。3．用MTT法检测索拉菲尼及PD98059对肝癌细胞的毒性．4．用westemBlot检测MAPK信号转导系统中ERKl、E砌Q及P．ERKl／2的表达。用生物发光

3、法检测下调ERK后耐药株的耐药性的变化。结果：1．ERKl、ⅢK2、刷K3与多药耐药的有相关性，其中以ERKl最为显著和稳定。ElⅨ1与p·gp、P53、Topo一Ⅱ呈明显的正相关。多药耐药的相关指标中Topo一Ⅱ与增殖相关蛋白PCNA、Ki．67存在明显的正相关。ERKl与K-r鹤及MRP3呈负相关。多药耐药和MAPK两类指标均不能将不同来源的(癌、癌旁和正常组织)原发性肝癌，复发性肝癌和转移性肝癌有效地进行区分。癌旁组织中多药耐药和有无累及肝被膜(Glic印)O，：O．007，厂=0．263)、门静脉癌栓(PVT)@=0．003，，．--O．286)显著相关；正常组织中多药耐

4、药和病理诊断(Diagnosis，包括原发性肝癌，转移性肝癌，复发性肝癌)◇=4．81E-06，，=-O．358)、肿瘤大小(size)C萨O．034，，．_-O．175)和病理组织学分类中的硬化型(sclerotic)泸O．031，严0．187)显著相关。癌组织中MAPK通路蛋白表达和临床病理诊断(Diagnosis)p=0．0003，，=0．263)指标显著相关；癌旁组织中MAPK通路蛋白表达和分化程度(Differentiation)(矿0．010，严0．210)指标显著相关；正常组织中MAPK通路蛋白表达和年龄(Age)◇=0。026，，．=·O．190)、AFP水平(A

5、FP)(矿0．038，F0．178)和病理组织学分类中的假腺样(pseud091aIldul神0，=0．035，，=0．182)显著相关。2．诱导得到2株细胞系。与亲本株相比，耐药株耐药指数均大于5，对多种化疗药耐受性增强，耐药基因、耐药蛋白表达上调2～10倍，并以高浓度冲击法诱导的细胞上调更显著。耐药细胞增殖活性升高20倍以上，细胞周期S期阻滞，体外侵袭能力增强1．3～2．5倍，ADM干预后，凋亡率减少50％以上。3．人肝癌耐药细胞株MAPK信号转导系统中不同基因和蛋白表达量均有不同比例升高，EIⅨ1、E砌Q升高明显。4．用PD98059后者索拉菲尼下调ERK的表达后，耐药株的

6、耐药性下降。结论：1．组织芯片技术是大规模平行检测多基因蛋白表达的一种有效方法；发现多药耐药相关蛋白和MAPK相关蛋白均与肝癌的临床特征和和预后转归有一定的相关性。2．MAPK信号转导通路与肝癌多药耐药的产生有相关性，且各个不同的亚通路相关性程度不同。癌组织MAPK通路中的ERKl的表达和多药耐药显著相关，EIⅨl和多药耐药的相关性是无组织特异性的；另外，和癌旁以及正常组织比较，癌组织中ⅢK2，ⅢK3和多药耐药的相关性将会被弱化，可能和肿瘤的发生、用药效果等有一定的联系。由ERKl导致的多药耐药可能与通过调节它的下游靶蛋白Topo—II影响细胞的增殖能力及上调膜转运蛋白p-gp的

7、功能有关。一⋯’3．ADM能够诱导多株人肝癌细胞产生多药耐药性。索拉菲尼和PD98059能有效抑制P．ERKl／2的表达。一‘’一’’⋯一。i·4．无论是在体内肝组织中还是在体外培养的肝癌细胞中，ERKl／2的表达都与多药耐药的关系密切相关。关键词：组织芯片肝细胞癌多药耐药№心KERKTissues111icroarray，h印atocellularcarciIloma’MunidrugresistanCe，MAPK，ERK，Abstractobjective1．Todetect