四醚脂质体作为口服载体的研究

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1、四醚脂质体作为口服载体的研究摘要生物大分子药物如蛋白、核酸等口服给药的生物利用度相当低，其原因之一在于蛋白或核酸等分子在苛刻的胃肠道环境中很不稳定，极易被胃肠道的酸性环境，多种蛋白酶，以及胆汁盐所降解。为了避免蛋白或核酸药物遭受胃肠道中的攻击，研究人员选用不同载体来保护这些生物活性药物。脂质体由于大小、表面电荷以及膜流动性的可控，作为口服载体的研究备受青睐。以酯键构成的普通脂质体，能够装载多肽或核酸药物，并对它们具有一定的保护作用。然而，普通脂质体作为口服输送载体，仍然面临的最大障碍之一就是：它们在肠道胆汁盐的作用下极不稳定，尤其是胆汁盐与肠道酶

2、协同作用时。因此，我们期望寻求更加稳定的脂质体以口服输送生物活性药物。古细菌脂质体是脂质体的一种，是由古细菌细胞膜上提取的脂质组成。古细菌脂质包括二醚脂质和四醚脂质。四醚脂质的核心部分就是由40个碳原子构成的饱和类异戊二烯侧链并通过醚键与甘油骨架的2、3位碳原子相连接。而普通脂质体中的磷脂侧链是由不饱和脂肪酸链组成，并以酯键与甘油骨架的1、2位碳原子相连接。另外，由四醚脂质形成的脂质体的膜是由多个具有单分子层跨度的醚脂组成，这种独特的结构给予四醚脂质体稳定的特性。本研究就是从古细菌Sulfolobusacidocaldarius提取四醚脂质iPL

3、FE，考察由PLFE制备的四醚脂质体的体外稳定性特征，并着重评价了四醚脂质体作为口服疫苗载体在诱导粘膜免疫、系统免疫和细胞免疫中的作用以及作为多肽药物（胰岛素）的口服输送载体在糖尿病小鼠中的降血糖效果。最后结合小动物成像等技术初步分析了四醚脂质体口服后的在胃肠道中的滞留情况。本论文研究的主要内容及结果总结如下：收集生长成熟的古细菌S.acidocaldarius，成功的分离纯化得到醚脂，并通过薄层层析分析、质谱分析、红外光谱分析以及核磁共振分析进行表征。分析结果均表明我们提取、分离和纯化得到的脂质为极性醚脂—PLFE。我们以薄膜分散法制备四醚脂质

4、体，并通过原子力显微镜对其进行形态表征，结果显示四醚脂质体外形成球形或近球形，分散效果好；颗粒边缘清晰且平均直径大小为210nm左右。这个结果也与激光粒度测定仪测定的结果一致。而且，Zeta电位测定仪测得四醚脂质体的表面电荷为-35.1mV，这样的电位使四醚脂质体具有好的分散性，不容易聚集。作为多肽药物和疫苗的口服载体，具有良好的稳定性特征是极其重要的。本研究中我们以钙黄绿素为渗透标记物，并模拟人的肠道环境在体外考察了普通脂质体和四醚脂质体对钙黄绿素的释放情况。结果表明：与普通脂质体相比，无论在模拟的肠道环境溶液中，由PLFE制备的四醚脂质体是相

5、当稳定的。基于醚脂的独特结构和四醚脂质体的稳定特性，我们着重评估了四醚脂质体作为口服载体在疫苗中的作用。结果表明，与普通脂质体ii相比，四醚脂质体包裹的卵清蛋白（OVA）溶液经口服后，BALB/c小鼠体内不但产生了持久的、更强的系统免疫反应，而且也利于粘膜+免疫反应的产生。而且，四醚脂质体在诱导体外CD8T细胞增殖反应方面也有着较普通脂质体超越的能力。为了初步探索脂质体经小鼠口服后的吸收或分布情况，我们首先借助于荧光标记脂质（Rhodamine-DHPE）来考察不同脂质体吸收后的情况，结果表明相对于普通脂质体，罗丹明标记的四醚脂质体被小肠吸收的总

6、量更高，而且持续吸收的时间更长。其次我们合成了Cy5.5-OVA作为水相的荧光标记蛋白，并通过小鼠体内成像系统考察不同脂质体口服后的滞留情况，结果同样表明：相对于普通脂质体，装载Cy5.5-OVA的四醚脂质体被小肠吸收的荧光强度更强，而且在胃肠中能持续更长的时间。这两个实验中，然而无论是标记的荧光脂质，还是标记的荧光蛋白，它们的吸收以及持续特性的结果都是一致的。而且，在罗丹明标记的脂质体吸收实验中，小肠各部位对颗粒吸收的程度也是不一样的。相对于普通脂质体，罗丹明标记的四醚脂质体更容易被小肠回肠的尾部吸收；而且从离体小肠的荧光影像实验也得到类似的结

7、果：四醚脂质体包裹的Cy5.5-OVA更多的被回肠下部分所吸收。这些也部分解释了四醚脂质体作为口服疫苗载体的体液免疫能力作用。然而真正的作用机理还需要进一步研究。尽管如此，我们的实验数据还是说明了四醚脂质体在发展成口服疫苗载体方面具有很大潜力。同时，我们也着重考察了四醚脂质体作为载体在口服胰岛素中的应用。首先，我们考察了普通脂质体和四醚脂质体在人工模拟的胃肠iii环境中对胰岛素的释放情况，结果表明相对于普通脂质体，无论是在胃环境还是肠道环境缓冲液中，由PLFE制备的四醚脂质体都是比较稳定的。其次，在体内试验中，我们建立的糖尿病小鼠口服不同的胰岛素

8、溶液后体内降血糖的效果是不一样的。即相比较胰岛素的PBS溶液和普通脂质体包裹的胰岛素溶液，四醚脂质体包裹的胰岛素溶液经口服后有着较大的降