微囊藻毒素-lr阻抗型免疫电化学检测方法的研究

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1、摘要微囊藻毒素．LR阻抗型免疫电化学检测方法的研究学科、专业：营养与食品卫生学入学时间：2007—09硕士研究生姓名：石慧答辩时间：2009一07指导教师：王洪新教授、孙秀兰副教授授予学位时间：微囊藻毒素．LR(MC．LR)是淡水水体中最普遍且毒性最强的一类蓝藻毒素。目前，藻毒素检测方法多需昂贵仪器且操作繁杂，无法满足快速检测的要求。因此，研究和建立一种快速，灵敏，简便的检测方法具有重要意义。本文以合成MC．LR完全抗原，制备特异性多克隆抗体为基础，并结合免疫传感技术和纳米材料自组装法等，构建电化学阻抗型免疫传感检测方法，主要研究内容如下：

2、采用“活泼酯法”和“碳二亚胺法”合成MC．LR免疫抗原及检测抗原。免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体，纯化后其效价高于5．2x104。通过间接竞争ELISA法作出MC．LR竞争标准曲线，线性范围为0．25-'--4pg／L,半数抑制率IC50为O．68肛∥L。除与MC—RR的交叉反应率约为21．9％外，与MC．LW，MC．LF的交叉反应率均小于1．O％。基于L．半胱氨酸(L．Cys)和纳米金(Nano．Au)固定抗体技术建立了MC．LR无标记型免疫传感检测方法。对MC．LR的阻抗响应线性范围为0．05"-'300ng／mL,最低检出限为1．82

3、x10五ng／mL(S／N=3)；检测时间仅为15mira对饮用水源水平均加标回收率在96．8％～112．5％之间：对修饰电极循环扫描42圈后，峰电流无显著变化，变异系数为3．58％；4。C下保存30天稳定性良好。基于1，6．己二硫醇(HDT)自组装技术和纳米金吸附作用相结合的方法固定微囊藻毒素抗体构建免疫传感器。结果表明，阻抗响应线性范围为0．25---95ng／mL，检出限达8．5×10之ng／mL(S／N=3)；电极的重现性及稳定性较好，对同一浓度连续测定8次，相对标准偏差为7．84％14。C下储存30天后阻抗响应信号无明显变化；应用

4、于饮用水，样品的平均加标回收率为92．6％～118．3％；检测时间为15min。基于多壁碳纳米管(MWNTs)／室温离子液体(RTILs)修饰电极固定抗体，构建了MC．LR免疫传感检测方法。本法具更高的灵敏度，最低检出限为1．7×10。3ng／mL(S／N=3)，在5x10弓-'--lxl02ng／mL范围内成良好的线性相关；对饮用水平均加标回收率为80．95％---．127．23％；水中常见的离子对于MC．LR的测定均无明显干扰。首次提出电极保护液的设计构想。基于室温离子液体的优良特性，在4。C下，对修饰电极的稳定性进行了长达60天的考察

5、，筛选出了具有有利于抗体蛋白维持其稳定性的离子液体及其最佳浓度。利用圆二色谱法初步探究了RTILs维持抗体蛋白的稳定性的机理，揭示了抗体蛋白在RTILs中的构象变化。本研究所建立的检测饮用水中MC．LR的阻抗型电化学免疫传感检测方法，灵敏、快速、方便，具有良好的发展前景，为实现直接、实时、原位、在线的MC．LR日常监测工作提供了重要的实验依据。关键词：微囊藻毒素．LR；多克隆抗体；免疫传感器；交流阻抗谱；室温离子液体AbstractRecently，withtheoccurrenceofwidespreadheavycyanobacteri

6、alblooms，severalseriouswaterandfoodsafetyepisodesinvolvingmicrocystinsisattractingglobalattention．Microcystin—LR(MC·LR)jsthemostcommonandtoxicinallcyanophyceantoxin．ExistinganalyticalmethodsforMC-LRhavemanydisadventagessuch舔highcost，tedioussamplepreparationandlowefficiency

7、．Therefore，thedevelopmentofahighlysensitiveandrapiddetectionmethodforMC-LRisofsignificance．Inthispaper,throughthepreparationofimmuneantigenandspecificantibodiestoMC—LR，animmunosensorwhichbaSedonimmunoassaytechniqueandself-aSsemblednano．materialWaSdevelopedforthedeterminati

8、onofMC．LR．Themainpointsofthisdissertationaresummarizedasfollows：Theimmunoanddetectionanti