微囊藻毒素-LR抗体的制备及自组装电化学免疫传感检测方法的应用.pdf

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1、ISSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmuno1)2010，26(8813·论著·文章编号：1007—8738(2010)08—0813—03微囊藻毒素-LR抗体的制备及自组装电化学免疫传感检测方法的应用孙秀兰’2，石慧，张银志，杨婷婷，赵春城。(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，江苏无锡214122；江苏苏微微生物有限责任公司，江苏无锡214036)[摘要]目的：制备微囊藻毒素一LR(简称MC—IR)多克隆抗1材料和方法体，并将其应用于电化学免疫传感器对MC—LR的测定。1．1材料CHI760C型电化学

2、工作站，购自上海辰华仪器公方法：通过对新西兰大白兔免疫自制免疫原MC—LR．KLH，制司；酶标仪Ml(3，购自上海智理科学仪器有限公司；酶标板备多抗。将所得抗体应用于电化学免疫传感技术，基于L．半(96孔，美国Costar公司)；MC—LR标准品(纯度I>97％)、匙胱氨酸自组装技术和纳米金吸附作用相结合的方法固定MC—孑L血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)均购自Sigma公司；LR抗体，采用循环伏安法(CV)以及交流阻抗法(EIS)研究了弗氏完全、不完全佐剂(Pierce)购自北京生物制品研究所；健该抗体在修饰电极上的电化学性质。结果：间接ELISA表明

3、康雄性新西兰大白兔(SCXK-(Army)2007-0010体质量2kg左纯化后的抗体效价能达到6．4×10；固定包被抗原MC．LR—右)购自江苏省农科院畜牧兽医研究所动物房；其他试剂均BSA，采用间接竞争ELISA测定标准曲线，定量检测区间为为分析纯。0．05—4L，半数抑制率为0．68g／L。将所制备抗体应用1．2方法于电化学研究中，成功地建立了阻抗型免疫传感器检测MC．1．2．1MC—LR人工抗原的合成(1)MC-LR活化：将0．5mgLR。该免疫传感器显示出响应速度快，15min内完成测定；灵敏MC—LR溶解于0．1mLDMF，加入溶解于DMF的EDC．H

4、C1度高，达到1．82×10L；线性范围广(0．05—200L)。0．75mg和NHS0．75mg，振荡5min，室温反应30min，4℃结论：制备的MC—LR抗体具有效价高，特异性强，应用于电化学冰箱过夜，得MC—LR活泼酯衍生物。(2)MC—LR与KLH偶免疫传感检测方法的研究中，体现出良好的发展前景。联：3mgKLH溶于3mL0．1mol／LpH9．6碳酸盐缓冲液中，[关键词]微囊藻毒素一LR；多克隆抗体；电化学；免疫传感器将上述MC—LR活泼酯衍生物缓慢滴加入KLH溶液中，混匀，[中图分类号]R392．11[文献标识码]B避光室温反应6h。反应结束后于0．

5、01mol／LpH7．4的PBS透析3d。第1天每3h换1次，后2d每天换3次，留样待鉴随着水体富营养化的加剧而引起蓝藻水华的频定，其余分装冷冻干燥，一20~C密封保存J。繁发生已成为国内外普遍关注的环境问题。其中微1．2．2MC-LR抗血清的制备用合成的MC．LR人工抗原囊藻毒素．LR(Microcystin．LR，MC．LR)是淡水水体中(MC—LR—KLH)免疫2只健康雄性新西兰大白兔。免疫前1危害最严重的一类蓝藻毒素，由于其发生普遍，持续周从耳缘静脉采血作阴性对照。称取1mgMC—LR—KLH，用时间长，且急性毒性最强，因而倍受人们的关注¨j。2mL0．1

6、mol／L的PBS(经高压灭菌)溶解，然后取0．5mL溶目前检测水体中MC．LR的方法有多种，如高效液相解的抗原与0．5mL完全福氏佐剂充分混合，充分乳化后在新色谱法(HPLC)、液质联用色谱(LC／MS)-3]。以西兰大白兔背部进行多点皮下注射。4周后进行第1次加强及酶联免疫吸附试验(ELISA)。采用电化学免疫传免疫，采用四肢内部肌肉注射，剂量与首次免疫相同，与等感技术快速准确地检测MC-LR的报道甚少。量不完全福氏佐剂混合充分乳化。共加强免疫6次，每次间本试验利用自制合成的MC-LR完全抗原，免疫新隔2周。每次加强免疫前从兔耳静脉采血，采用间接ELISA法测

7、定抗血清的效价。效价合格后，兔颈动脉放血，分离抗西兰大白兔获得抗血清；经纯化后获得多克隆抗体，血清，并采用饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体，制成冻干粉，于对其进行了全面的评价；并应用于电化学免疫传感器一20~C保存。的研制，将免疫测定法与传感技术相结合而构建的第1．2．3MC—LR抗体的评价(1)抗体效价的测定：以间接3代无标记型免疫传感器，用于MC—LR的测定，结果ELISA法测定抗体效价。用MC—LR—BSA偶联物(2．5mg／L，理想，该方法具有良好的推广和应用的潜力。PBS)包被酶标板，每孔100，4~C过夜；每孔加封闭液250，37~C孵育1．5h；将一定浓度的

8、抗血清加入