番茄斑萎病毒实时荧光定量pcr快速检测方法建立论文

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1、原创性声明lIIIIIIIilililIIIHIY2425562本人声明，J行呈交的学位论文是本人在导师指导’l。进行的形『究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文一p特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：亟f丑茈L三IJtJ#：兰盟L年羔月丑日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，

2、允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。储虢驰翩签名诹隗鄙年上月毕日番茄斑萎病毒实时荧光定量PCR快速检测方法的建立摘要：番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TSWV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的代表成员，该病毒的寄主范围广泛，对农业生产危害严重。已经被列为世界危害最大的十种植物病毒之一。TSWV目

3、前尚无有效的防治措施，研究该病毒快速高效的检测方法，有助于早期发现病毒并及时采取措施进行防治，从而减轻该病毒所造成的经济损失。本实验利用SYBRGreenI实时荧光定量PCR技术，建立了TSWV的快速定量定性检测方法。根据TSWV外壳蛋白N基因序列，设计了实时荧光定量PCR的特异性引物，获得了140bp大小的片段，并将小片段克隆到PEASYTM—T5载体上，经过菌落PCR筛选、酶切、测序等结果表明，PCR扩增获得片段与N基因部分片段同源性高，表明设计的引物特异性好；且该片段已经成功连接至载体，得到了重组质粒。以得到的重组质粒作为实时荧光定量PCR的

4、标准品，对标准品进行一系列的梯度稀释，选择6个梯度稀释的标准品为模板进行SYBRGreenI实时荧光定量PCR反应，得到的标准曲线回归方程为y=一3．538x+37．233，该扩增反应的效率为91．7％，相关系数为0．978，检测范围为9．84×101copies／gL一'9．84×t06copies／“L。熔解曲线只出现特异性的单个峰，而没有明显的引物二聚体或者非特异性扩增的峰出现，证明该方法具有良好的特异性。组间和组内的重复性实验的结果CV值均小于3％，表明该方法具有良好的重复性和稳定性。样品检测结果表明，荧光实时定量PCR方法与ELISA和常

5、规RT-PCR分析结果一致，而荧光实时定量PCR方法可以定量病毒含量。关键词：番茄斑萎病毒；SYBRGreenI实时荧光定量PCR；检测分类号：$432．1DevelopmentofaReal—timePCRforRapidDetectionand一●一●n，’nT●1●UUantltlCantlOnot』omatospottedwlltvirusAbstract：Tomatospottedwiltvirus(TSWV)，therepresentativememberoftheTospovirusinthefamilyBunyaviridae，ha

6、sbeenregardedasoneofthetenmostharmfulplantvirusesintheworldforitswidehostrangeanditshugeeconomiclossduringagriculturalproduction．Therearenoeffectivepreventionandcontr01measurestoTSWV，therefore，studyingfastande￡ficientmethodofTSWVdetectioniShelpfultofindoutthevirusandtakemeasur

7、esintimeastoreducetheeconomiclOSScausedbyit．ThisstudyestablishedarapidquantitativeandqualitativemethodtoTSWrVwiththeadoptionofSYBRGreenIreal—timePCR．AccordingtothecoatproteinNgenesequenceofTS、VV．designedthereal—timePCRspecificprimers，thenobtained140bpfragmentsandconstructedthe

8、plasmidbyinsertthe140bpfragmentsintothePEASY¨Ⅵ．T5vector．Based