榄香烯及消癌平诱导宫颈癌细胞hela凋亡作用及机制

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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意．申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即

2、：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学．本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），以采用影印、缩印或其他手段保存论文。鼻论文作者签名：垒！兰指导教师签名：幺缨望多日期：垒２：￡：堑’・中文论著摘要・榄香烯及消癌平诱导宫颈癌细胞ＨｅＩａ的凋亡作用及机制刖昌榄香

3、烯（Ｅｌｅｍｅｎｅ）是我国首先从活血化瘀中药姜科植物温莪术（ＣｕｒｃｕｍａａｒｏｍａｔｉｃａＳａｌｉｓｂ）中提取出的一种抗癌有效成分。近３０多年的基础研究和临床应用证实，榄香烯具有抗瘤谱广、疗效确切、毒副作用小等特点。目日ｉ广泛用于各种肿瘤的临床治疗。消癌平是乌骨藤的灭菌水溶剂，临床上用于胃癌及晚期肝癌的动脉介入治疗取得较满意的疗效。宫颈癌Ｈｅｌａ细胞是一种对药物及外界环境较耐受的一种细胞，宫颈癌的治疗在临床上也是难点，本研究就榄香烯（ｅｌｅｍｅｎｅ）及消癌平对宫颈癌细胞株Ｈｅｌａ的作用及机制

4、进行探讨，以期通过对两种中药的体外抑瘤效应的研究来揭示中药抗肿瘤的作用机制及其二者有何异同，是否与既往杂志报道的包括增敏，诱导细胞凋亡、使蛋白表达下调等诸多机制相符，进而总结出在所有机制中起主导作用的是哪一种。本研究只是一系列研究的开端。目的本研究就榄香烯（ｅｌｅｍｅｎｅ）及消癌平对宫颈癌细胞株Ｈｅｌａ的作用及机制进行探讨，以期通过对两种中药的体外抑瘤效应的研究来揭示中药抗肿瘤的作用机制。实验材料与方法２ｌ、细胞增殖抑制试验取对数生长期的Ｈｅｌａ细胞接种于９６孔培养板，加入不同浓度的榄香烯及消

5、癌平，使其终浓度分别为０，２５，５０，１００，２００，４００ｌＩｇ／ｍｌ，最后利用酶联检测仪５７０ｎｍ＇波长处测定吸收度Ａ值，并求值ＩＣ５０值。分别用流式细胞仪检测细胞周期变化和凝胶电泳检测凋亡梯度并收集不同浓度榄香烯及消癌平作用过的Ｈｅｌａ细胞利用透视电镜技术观察细胞形态及Ａ０荧光染色检查细胞染色质和ＲＮＡ的变化和细胞超微结构的变化。２、Ｂｃｌ一２蛋白水平检测收集不同处理组作用４８ｈ的Ｈｅｌａ细胞，加入ＲＩＰＡｂｕｆｆｅｒ取上清后用ＢＣＡ方法测定蛋白质浓度，经过室温杂交２ｈ，ＰＢＳＴ洗膜后

6、加入ＨＲＰ标记兔抗羊抗体（１：５０００），室温杂交ｌｈ，ＰＢＳＴ洗膜后进行ＥＣＬ显色。３、统计学处理样本均数的比较采用Ｄｕｎｎｅｔｔ检验。结果１、榄香烯、消癌平对Ｈｅｌａ细胞增殖抑制作用榄香烯及消癌平２５～４００ｕｇ／ｍｌ作用７２ｈ对Ｈｅｌａ细胞体外增殖有显著的抑制作用，呈剂量依赖性。流式细胞仪分析榄香烯、消癌平及二者联合应用细胞凋亡率明显优于两药单独应用。当作用６ｈ时，Ｇｌ期细胞稍下降，Ｓ期细胞逐渐增多：作用１２ｈ时，Ｓ期细胞发生阻滞：作用２４ｈ时，亚Ｇ１期细胞显著增多，出现明显的亚二倍体峰，

7、对照组无此特征。利用倒置显微镜观察细胞形态可见各药物组细胞皱缩、变小，而对照组细胞大小均一；ＡＯ染色显示药物组细胞染色质凝聚、破裂。胞内出现微核样结构，胞质颜色变浅，而对照组细胞核为黄绿色，较大，胞质橙红色电镜下可见具有典型新月形核的凋亡细胞，并有凋亡细胞产生膜完整的凋亡小体。２、Ｂｃｌ－２蛋白水平检测１００ｌｌｇ／ｍｌ榄香烯、消癌平及二者联合作用７２ｈ，１％琼脂糖凝胶电泳获得清晰的凋亡特征性梯形条带。结论本研究采用不同浓度的１３一榄香烯、消癌平及二者联合作用于宫颈癌Ｈｅｌａ细胞，发现了榄香烯

8、及消癌平对宫颈癌Ｈｅｌａ细胞的体外增殖均有明显抑制作用，且具有协同作用。榄香烯及消癌平均可明显诱导细胞凋亡，其诱导凋亡作用呈药物浓度及作用时间依赖性，说明榄香烯及消癌平均可以通过诱导细胞凋亡的方式，发挥其抗癌作用。Ｂｃｌ－２蛋白水平表达检测分析表明，在榄香烯及消癌平在诱导肿瘤细胞凋亡时均伴随有Ｂｃｌ一２蛋白水平表达的下调，所以Ｂｃｌ－２下调在榄香烯及消癌平诱导宫颈癌Ｈｅｌａ细胞凋亡过程中也是一个重要因素。提示榄香烯及消癌平在诱导细胞凋亡的过程中很可能均通过某种途径作用于ｂｃｌ－２基因，从而使其表