多西环素对兔膝关节骨关节炎软骨及滑膜中mmp-3和timp-1+mrna表达的影响

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1、OAMMP．3ACLTIMP．1RTPRC英文缩略语OsteoarthritisMetalloproteinases-3AnteriorcruciateligamentTissueinhibitorofmetalloproteinases-1ReversetranscriptionPolymerasechainreactionV骨性关节炎金属蛋白酶．3前交叉韧带金属蛋白酶组织抑制因子．1逆转录聚合酶链式反应原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含

2、为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：日期：』年上月4日关于学位论文使用授权说明本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：翩签名墅叁眺趟年鲥必-^上-—JL刖舌OA疾病是机械性和生物性因素相互作用，使关节软骨细胞

3、、细胞外基质和软骨下骨合成与降解的正常进行失去平衡的结果【11。软骨损伤可引起关节肿胀、疼痛，甚至不同程度的功能障碍，但也有相当一部分人没有任何症状。因此临床诊断有一定的困难。近年来随着对OA研究的深入，对OA造成的软骨损伤有了进一步的认识，但是有关关节面损伤的机制和概率的系统性研究仍然缺乏【2】。随着生活节奏的不断加快和工作、社会压力的不断增高，OA发病率有所上升。体重、年龄、性别、职业活动、非职业性体力活动、骨矿密度(bonemineraldensity,BMD)等都是OA的相关因素【3】。在Framingham研究中，女性每年发生的X线检查膝关节OA为2％，症状性关节OA为l％：男性的

4、比值分别为1．4％和0．7％141。国内流行病学调查显示OA的人群患病率为4％，男性和女性膝骨关节病的患病率峰值分别为24．7％和54．6％【51。近年来国内外学者在关节软骨的生物力学方面的研究表明，由于创伤、冲击、关节负荷异常、过度劳损以及部分的衰老过程，可导致组织的组成、结构和性质发生改变。当关节软骨承受负荷的强度或频率异常，就有可能发生关节软骨损害【6,7,8】。软骨负荷超过一定临界值时将出现不可逆性损害19'1训。一旦关节软骨损伤造成结构性改变，往往缺乏自我修复机制。大多数作者认为，软骨破坏会逐渐发展、扩大，而不会局限、停止，终将影响到关节功能，出现关节疼痛，运动障碍，发展成为OA[

5、11,12,13】。对骨关节炎的深入研究发现，基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)是介导软骨破坏的重要因子。MMP一3属于MMP超家族中的基质溶解素亚家族，对蛋白聚糖有高度的裂解活性，还能裂解纤维连接素、层连蛋白、弹性蛋白以及Ⅵ型和Ⅸ型胶原，并能激活MMP一1降解II型胶原，使关节软骨肿胀，抗外力作用下降，在持续的高强度应力负荷作用下，最终导致关节软骨进行性破坏。因而在OA发病中的作用尤为重要114J。TIMP．1是MMP的特异性抑制剂，通常TIMP与MMP以酶原形态按照1：l结合，从而阻止酶的激活，而当酶已经激活时，可直接抑制酶的活性【l51。针对上

6、述问题，本实验通过ACLT建立创伤性骨关节炎动物模型，并在膝关节腔内注射多西环素，观察多西环素对兔骨关节炎关节软骨和滑膜中MMP．3、TIMP．1mRNA的影响，从而探讨多西环素在治疗骨关节炎方面的作用机制，为临床预防与治疗创伤性骨关节炎提供实验依据。1．1主要材料第一章材料与方法1．1．1实验动物成年健康新西兰大白兔16只，体重1．5"---2．0kg，平均1．83kg，雌雄不限。由湖南省人民医院临床实验室提供。1．1．2主要试剂兔beta—actinDNA序列MMP一3、TIMP一1DNA上下游引物RT试剂盒，PCR试剂盒Trizol注射用多西环素注射用青霉素1．1．3辅助试剂液氮三氯甲

7、烷(分析纯)异丙醇(分析纯)DEPC水1．1．4主要仪器SartoriusCP225D电子分析天平Eppendorfcentrifuge5415R离心机TGL一16A台式高速冷冻离心机DDY--7C型电泳仪GeneAmpPCRsystem9700Syngene凝胶成像系统UV-2550分光光度议2武汉博士德生物工程公司合成上海生工生物工程公司合成美国Ferments公司生产美国Invitrigen公司生产哈尔