nlrp3炎性复合体在大鼠创伤性脑损伤后表达及作用机制的研究

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1、硕士学位论文JIllllIrlllllMIIIIIUlY2406125p炎。国在姗愀脑损伤后表达及作用机制研究硕士研究生：刘寰东指导教师：杭春华教授摘要研究背景：创伤性颅脑损伤(traumaticbrainmjury，TBI)是中枢神经系统的常见病和多发病，其可直接破坏颅内结构，导致患者神经系统功能严重受损，甚至可出现植物生存状态或危及生命。尤其是中、重型颅脑外伤对患者的生存时间、神经功能的影响巨大。随着经济及交通的发展，创伤性颅脑损伤的发生率逐年上升，较高的致残率和死亡率己使其成为影响人类健康的首要因素，并越来越多的引起临床医生及科研

2、学者的重视。近年来，科研工作者们从不同角度对颅脑损伤的发生原因、生物力学机制、病理生理学、病理形态学及分子病理学变化等方面进行了广泛而深入的研究，并取得了很大的进步，新的理论不断产生和发展，但是目前仍然没有明显有效的治疗措施能减少死亡率和致残率。TBI后的复杂的病理生理过程及其精确的调控机制至今仍然不完全清楚。目前认为，TBI后脑的损伤可分为原发性脑损伤和继发性脑损伤。原发性脑损伤主要包括：脑震荡、弥漫性轴索损伤、脑挫裂伤、外伤性蛛网膜下腔出血(Traumaticsubarachnoidhemorrhage，tSAH)等。另外，继发性脑

3、损伤已经被证明在外伤后的一系列病理过程中起着关键作用。尽管二次脑损伤的精确机制尚未完全研究清楚，但炎症反应已经被证实在继发性脑损伤中起着关键作用。细胞因子是由活化细胞产生和分泌的能够影响其他细胞或分泌细胞自身生长、分化和增值，并且与免疫活化和炎症反应具有重要关系的一类可溶性多肽递质，它包括白细胞介素(ILs)、趋化因子、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(INF)、I硕士学位论文containing3)炎性复合体是NLRs家族中被研究最广泛的成员之一，它的构成包括：NLRP3骨架、凋亡相关斑点样蛋白(apoptoticspeck—conta

4、iningprotein，ASC)、Pro—caspase．1。有研究显示NLRP3炎性复合体可被多种DAMP及PAMP激活并与包括阿尔兹海默病(Alzheimer'sdisease，AD)、亨廷顿氏舞蹈病(Huntington’Sdisease，HD)、肺炎球菌性脑膜炎在内的多种中枢神经系统疾病有关，而NLRP3炎性复合体在星形胶质细胞及小胶质细胞中存在。星形胶质细胞及小胶质细胞对维持脑组织正常生理功能，应对损伤或疾病方面起着重要作用。在病理情况下，IL．1D被星形胶质细胞和小胶质细胞迅速的合成、释放。然而，有研究表明神经元同样与脑外

5、伤后涉及IL一1D的炎症反应有所牵连。KeaneRW等人已经报道了NLRPl炎性复合体在脑外伤神经元细胞中的表达及其可能的作用。因此，我们假设NLRP3炎性复合体可能参与了TBI后炎症反应的发生于调控。据我们所知，目前NLRP3炎性复合体在TBI后脑组织中的表达尚未有文献报道，基于巾圆此，我们设计了本项课题，通道建立大鼠TBI模型，及双氧水(H202)刺激星形胶质细胞的体外细胞损伤模型，来研究TBI后NLRP3炎性复合体的表达，并阐明其在二次脑损伤中潜在的作用机制。目的：1．体内实验：通过建立大鼠TBI模型，测定创伤后皮层NLRP3、A

6、SC、Caspase一1的表达量，观察创伤皮层组织形态学改变及NLRP3炎性复合体的细胞定位，检测下游IL．1p的水平，阐明NLRP3在TBI后炎症反应中的作用。2．体外实验：原代培养星形胶质细胞，以双氧水刺激，建立细胞损伤模型，检测NLRP3炎性体在体外细胞中的表达，结合体内实验，明确NLRP3炎性体在神经细胞炎症反应中的潜在作用。方法：1．体内实验部分摘要1．1分组及模型SD成年雄性大鼠(250—3009)72只，采用改进的Feeney’S自由落体撞击方法制作重型TBI模型。将大鼠以每千克体重50毫克计量的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，切

7、开头皮，在右侧顶骨处以牙钻打开一个直径约5mm的骨窗，同时保证硬脑膜的完整。骨窗的中心点位置在前囱后1．5mm，中线旁开2．5mm处。然后把大鼠固定住立体定位仪上，以40克圆柱形撞击锤从25cm高度沿垂直金属杆自由下落，建立损伤模型。同时假手术组仅仅打开骨窗。将72只SD大鼠随机分为6组(每组12只)：正常对照组(normalgroup)、假手术组(shamgroup)、创伤性脑损伤组(TBI组)。其中TBI组又按时间点分为：6小时组、l天组、3天组、7天组。在对应的时间点给予SD大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，以预冷的磷酸盐缓冲盐水进行左

8、心室灌注，然后断头，收集挫伤周围的脑组织并立即保存在液氮中，存放于一80℃直到使用为止。依据之前的实验分析，假手术组在任何时间点的取材其待测变量变化无明显统计学差异，所以我们统一在大鼠开骨窗后6小时取材，并