c6神经酰胺诱导结肠癌细胞自噬和信号机制的研究

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1、上海交通大学医学院IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIMIIHIIY2351531博士学位论文c6神经酰胺诱导结肠癌细胞自噬和信号机制研究AStudyonC6Ceramide——inducedAutophagyPathwayanditsSignalMechanisminCulturedColonCancerCells研究生：火海钟导师：顾岩教授专业：外科学(普外科)申请学位：博士资助项目：上海交通大学医学院附属第九人民医院院级基金课题(J、／20lIhl7)上海交通大学医学院附属第九人民医院院重点学科基金研究方向：结肠癌培养

2、单位：上海交通大学医学院附属第九人民医院关键词：结肠癌，C6短链神经酰胺，磷酸腺苷活化蛋白激酶，自噬Keywords：coloncancer,C6ceramide，AMPK,autophagy二零一三年四月一苓一二，半四月上海交通大学上海父逋大字学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人

3、承担。学位论文作者签名：日期：2013年4月12日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。(请在以上方框内打“4”)学位论文作者签名：指导教师签名：日期：2013年4月12日日期：2013年4月12日上海交通大学医

4、学院博士学位论文C6神经酰胺诱导结肠癌细胞自噬和信号机制研究中文摘要背景：结肠癌是癌症相关死亡的第二大原因。耐药性及对正常细胞的毒性限制了目前的化疗方案治疗结肠癌效果。寻找化疗替代药物是目前临床及基础研究的热点。目的：在体外培养的结肠癌}{T一29中，我们研究了具有细胞通透性的短链神经酰胺c6(C6ceramide)细胞毒性作用，重点明确其细胞毒作用的机制。方法：MTT(3一(4，5一二甲基毗啶～2一基)-2，5一二苯基溴化)法，集落形成试验和台盼蓝被用来测试的HT一29细胞存活。AnnexinV染色，组蛋白一DNAELISA法

5、和Caspase一3活性法用来评估HT一29细胞凋亡。包括Ulkl、LC3B及Beclin一1自噬相关蛋白用Westernblot检测。Westernblots测定磷酸腺苷酸活化蛋白激酶(5’AMPactivatedproteinkinase，AMPK)激活。AMPK的活性调控则由shRNA敲除或基因突变(组成性激活，CA)来完成。结果：我们观察到C6神经酰胺剂量和时间依赖性诱导的HT一29细胞死亡。然而，在C6神经酰胺处理的HT一29细胞中，并没有观察到显著的细胞凋亡。结果显示，在HT一29细胞中，C6神经酰胺自噬性细胞死亡。

6、自噬抑制剂3～墨ethyaldenine(3一凇)和羟氯喹抑制C6神经酰胺的细胞毒作用，而自噬激活剂依维莫司(RAD001)和上海交通大学医学院博士学位论文temsirolimus模拟C6神经酰胺的作用，并诱导HT-29细胞死亡。此外，运用分子生物学方法，我们证实，C6神经酰胺通过活化A御K／Ulkl信号通路而诱导HT-29细胞自噬。shRNA沉默AMPK抑制C6神经酰胺诱导的自噬和HT-29细胞毒效应。反之，AMPK活化剂AICAR，或CA—AMPK涛导细胞自噬和死亡。结论：我们的研究结果表明：自噬，而不是凋亡参与c6神经酰胺

7、诱导HT-29细胞毒作用，活化心PK／Ulkl信号通路参与上述过程。关键词结肠癌，c6短链神经酰胺，磷酸腺营活化蛋白激酶，自噬上海交通大学医学院博士学位论文AStudyonC6Ceramidel_，inducedAutophagyPathwayanditsSignalMechanisminCulturedColonCancerCellsBACKGROUND：ABSTRAcTColoncanceristhesecondleadingcauseofcancer—relateddeaths．Drugresistanceand／orof

8、f-targettoxicityagainstnormalcellslimittheeffectivenessofcurrentchemotherapiesforthetreatmentofcolorectalCanCer．Objective：Inthecurr