体外脑胶质瘤干细胞放化疗抵抗性研究

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1、博士学位论文体外脑胶质瘤干细胞的放化疗抵抗性研究博士研究生：蔡润指导教师：马廉亭摘要在全身恶性肿瘤中，恶性胶质瘤的5年死亡率就仅次于胰腺癌和肺癌，5年生存率不足5％。脑胶质瘤约占颅内肿瘤的半数以上，脑胶质瘤的发病率为3⋯10／10万，占全身恶性肿瘤的1⋯3％。低级别胶质瘤在病理上近于良性，侵袭性较小，即便如此，仍有将近一半的病人存活期不超过5年，肿瘤将从恶性程度较低的胶质瘤发展到恶性程度较高的胶质瘤，最后患者差不多都由于肿瘤复发和／或局部侵袭而死亡。目前手术切除是胶质瘤是最基本、最直接的治疗方法，治疗作用十分明确，其主要目的是降低致残率和死亡率，

2、最大程度的提高患者的生存质量和生存时间。但由于胶质瘤多呈侵润性生长，手术过程中难以通过肉眼分辨其明确边界，肿瘤常常难以彻底完全切除，因此在术后常常需要辅以放疗、化疗【1J。另有～部分患者因病变较小、位于功能区或因年龄较大、身体一般状况差，拒绝或不宜行开颅手术治疗而单纯选择放疗或化疗作为治疗手段。放射治疗主要是利用放射线的穿透性和使生物细胞电离的特性，常用的射线有x线和Y线等，x线和Y线等进入组织后和活体组织中的原子相互作用，传递电离辐射能量。具有生物活性的组织吸收电离辐射能量后产生一系列异常复杂的物理、化学和生物学变化而导致组织的放射性损伤。放射

3、治疗包括普通放射治疗、组织问的近距离照射和精确放射治疗，精确放射治疗又包括三维适形或调强放射治疗以及立体定向放射治疗(即X刀、Y刀)。无论采用哪种放射治疗方法，中文摘要它们均是通过使用X射线、Y射线等引起肿瘤组织、细胞的电离辐射效应而达到治疗目的【21。胶质瘤的化学药物治疗和手术、放射治疗一起构成了胶质瘤综合治疗体系，化学治疗可以杀死手术后或者放疗后的微小病灶，延缓胶质瘤的复发；或者使原本不能手术或不适宜手术的病人可以接受手术。但化学药物治疗也有比较大的副作用，全身用药毒性较大，同时可能对患者的免疫系统造成抑制。化学治疗药物分为两大类，分别为细胞

4、周期特异性药物和细胞周期非特异性药物。在选择化疗方案时常常考虑两类药物联合使用。虽然目前胶质瘤的综合治疗体系包括手术、放疗和化疗以及目前正在进行临床研究的基因治疗、免疫治疗等，但是胶质瘤的疗效在10余年内仍然没有明显进展，最后患者几乎由于肿瘤局部扩散或局部侵袭或复发死亡。特别是恶性胶质瘤的治疗，即使手术加放化疗的中位生存期也仅为14．6个月【4l。目前神经外科学者普遍认为，胶质瘤治疗的关键问题在于现有治疗不能有效抑制或延缓肿瘤复发。最近的研究认为【6J，肿瘤是由一小群具有无限增殖及自我更新能力的干细胞样细胞及由其产生的分化程度不均一的细胞团组成，

5、这群干细胞样细胞被称为肿瘤干细胞(Tumorstemcell，TSC)，而肿瘤的主体却是由失去了自我更新能力的具有一定分化特征的非干细胞样细胞组成。肿瘤干细胞假说最重要的特征是，肿瘤中仅肿瘤干细胞具有产生肿瘤及导致肿瘤治疗后复发的能力。肿瘤干细胞学说【7】的提出对于认识肿瘤的本质，开发新的肿瘤治疗方法具有重要意义，传统的治疗方法，包括手术、放疗和化疗，是以整体肿瘤细胞作为治疗靶的，并没有专门针对于肿瘤干细胞。治疗的结果就极有可能剩下具有致瘤性并对治疗具有更强抵抗性的肿瘤干细胞，从而导致肿瘤容易复发，难以根治。胶质瘤干细胞就是在此基础上逐渐提出来的

6、，最早被称为神经干细胞样细胞(neuralstem．1ikecell)。胶质瘤干细胞学说的重要意义在于，如果我们能够特异性的识别胶质瘤干细胞，并开发出特异性针对胶质瘤干细胞的靶向治疗方法我博士学位论文们就才有可能彻底征服胶质瘤。根据上述肿瘤干细胞和胶质瘤干细胞的学说，认为在脑肿瘤组织和体外培养的胶质瘤细胞系中存在有胶质瘤干细胞，并且由于胶质瘤干细胞对目前的治疗方法具有一定的抵抗作用而导致胶质瘤在治疗后部分干细胞存活下来，导致胶质瘤在术后出现复发。本课题就是在这样的思路下进行设计进行的。首先在第一部分，我们将两例新鲜恶性胶质瘤组织细胞和U251细胞

7、接种在含血清培养基中，待细胞生长良好时，将细胞接种至无血清培养基中(DMEM／F12培养基，内含B2720ul／ml，bFGF20ng／ml，EGF20ng／ml，LIF10ng／m1)收集悬浮生长的神经球样细胞，这些神经球样细胞经过无血清培养、传代和扩增后，再通过免疫荧光细胞化学的方法来检测这些神经球样细胞是否表达干细胞表面标志物CDl33和ABCG2；再通过流式细胞仪检测在无血清培养基中悬浮生长形成的球样体细胞CDl33和ABCG2的表达；然后运用免疫磁珠分选的方法，以CDl33为标志物，分选出CDl33表达阳性的胶质瘤干细胞；通过反复传代培

8、养的方式、单细胞克隆形成的方法和细胞移植裸鼠致瘤等方法来对其干细胞特性进行检测。结果我们发现，在新鲜的胶质瘤组组织细胞和U251细胞系中