phterttumstatin载体构建与其抗血管形成

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1、GeneratedbyUnregisteredBatchDOCTOPDFConverter2010.2.301.1358,pleaseregister!山西医科大学硕士学位论文Tris-base3.03gGlycine14.4gMethanol200mlPH8.2-8.4去离子水定容至1L，4℃避光保存，一周内使用。7)10×缓冲液TBST.Tris-base15gNacl44gTween4mlPH8.0去离子水定容至500ml，高压灭菌后4℃保存,使用时稀释10倍。3主要仪器与设备1)5417R冷冻离心机：Eppen

2、dorf2)GenPro基因扩增仪TC-E-96G3)核酸蛋白测定仪：Eppendorf4)KDC-40低速离心机:中佳5)HF90CO2培养箱：HealForce6)DYCZ-24DN迷你双垂直电泳仪：北京六一仪器厂7)DYCP-40C半干式碳板转印仪:北京六一仪器厂8)DYCP-31C琼脂糖水平电泳仪:北京六一仪器厂9)凝胶成像分析系统：VILBERFranch10)THZ-C恒温振荡器：江苏太仓实验设备厂11)倒置显微镜：OlympusJapan12)荧光显微镜：OlympusJapan13)YJ-875型医用超

3、净台:苏州净化设备公司14)StarFax2100型板式酶标仪:美国Awareness公司15)隔水式电热恒温培养箱:上海跃进医疗器械一厂16)-80℃低温冰箱：SanyoUltraLawCo.17)JA1003型电子精密天平：上海恒平科学仪器有限公司18)精密PH计：上海市精密科学仪器有限公司4质粒制备4.1质粒pCMV-Tumstatin的构建3GeneratedbyUnregisteredBatchDOCTOPDFConverter2010.2.301.1358,pleaseregister!山西医科大学硕士学位

4、论文4.1.1pIRES2-EGFP质粒及目的基因tumstatin载体质粒双酶切鉴定BamHI2.0ulBamHI2.0ulXhoI2.0ulXhoI2.0ul10×BufferK4.0ul10×BufferK4.0ul质粒pIRES2-EGFP3.0ul目的基因质粒3.0ulH2O29ulH2O29ulTotal40ulTotal40ul37℃恒温水浴4h后，分别取酶切产物15ul，加入3ulLodingBuffer混匀后加样于0.8%的琼脂糖凝胶中，同时加入5ulDL10,000DNAMarker,80V电压，4

5、0min后凝胶成像分析系统下拍照。4.1.2载体与目的基因tumstatin的连接按照琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒操作说明纯化回收酶切片段；①纯化的目的基因酶切产物15ul,质粒pIRES2-EGFP（不含CMV）15ul,10×Buffer4ul，灭菌去离子水4ul，T4DNA连接酶2ul，混合均匀后置于16℃过夜。4.1.3连接产物的转化及鉴定取连接产物10μl加入至100μlJM109感受态细胞中，混匀，冰中放置30min,42℃水浴1min,迅速置于冰上1min,加入890μlLB培养基(不含Kar)，37℃50r

6、pm振荡培养1h;低速离心弃上清，取100μl均匀涂布到含30ug/mlKar的LB固体培养皿上，室温放置15min后，倒置于37℃恒温孵箱中培养过夜。挑取白色菌落，摇菌扩增后，抽提鉴定。4.2phTERT-tumstatin质粒的构建4.2.1引物设计以pGL3-hTERT-tk为模板，PCR扩增hTERT启动子基因片段，并在hTERT启动子基因上下游分别加入限制性内切酶NdeI、BagII酶切位点。根据Genebank,引物设计如下：上游引物P1:5’GGGAATTCCATATGAGTGGATTCGCGGGCACA

7、3’下游引物P2:5’GGAAGATCTCGCGGGGGTGGCCGGGGCCAGGGC3’4.2.2PCR反应反应体系:4GeneratedbyUnregisteredBatchDOCTOPDFConverter2010.2.301.1358,pleaseregister!山西医科大学硕士学位论文10×TaqBuffer5µldNTP(10mM)1.0µlForwardPrimer(10µM)2.0µlReversePrimer(10µM)2.0µlTemplate2.0µlTaq(2U/µl)0.5µlH2O33.

8、5µlTotal50µlPCR程序：Setp195°C5minSetp295°C30SSetp355°C30SSetp472°C30S(2-430cycles)Setp572°C10min1.5%琼脂糖凝胶上对上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定正确后纯化回收，方法同上。4.2.3目的基因与载体的双酶切NdeI2.0ulBa