phtert-tumstatin载体构建与其抗血管的形成

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1、山西医科大学硕士学位论文phTERT-tumstatin载体构建及其抗血管形成摘要肝癌细胞的无限增殖和新生血管的不断形成是肝癌难以有效控制的重要原因。肝癌细胞端粒酶的激活是其无限增殖的基础，研究证实肝癌细胞中端粒酶活性高表达源于其hTERT（端粒酶逆转录酶）基因启动子的完全开启。血管生成是肿瘤存活和转移的关键过程，靶向抑制肿瘤新生血管的生成可间接抑制肿瘤的生长和转移。HCC是高度血管化的肿瘤，因此利用肝癌细胞特异的hTERT启动子驱动抗血管形成基因以达到靶向抑制肝癌新生血管的形成将是一个有前景的治疗策略。目的：构建由hTERT启动子驱动的肿瘤抑素基因载体，即phTERT-tumst

2、atin质粒，脂质体方法转染入肝癌细胞，观察由hTERT启动子驱动的肿瘤抑素基因在肝癌细胞内特异地表达、分泌及其体外抗血管形成效应。方法：1.体外培养人肝癌细胞HepG2、人正常肝细胞L-02、人血管内皮细胞HUVEC。2.构建phTERT-tumstatin质粒以及对照组质粒;3.脂质体转染HepG2、L-02细胞;4.荧光显微镜检测EGFP的表达,Westernblotting检测目的基因Tumstatin在HepG2细胞的表达、分泌；5.MTS法检测稳定转染后HepG2细胞的增殖活性;6.MTS法检测含或不含目的蛋白的条件培养基对HUVEC细胞增殖活力的影响。7.通过计数内皮

3、细胞在基质胶上形成的管样分支数观察目的蛋白对HUVEC细胞管道结构形成的影响。结果：1.成功构建了质粒phTERT-tumstatin、pCMV-tumstatin（阳性对照）、phTERT-EGFP（阴性对照）；2.pCMV-tumstatin质粒在HepG2和L-02细胞中均有荧光表达（图2-1、2-2），phTERT-tumstatin仅在HepG2细胞中有荧光表达，L-02细胞中几乎无表达，说明hTERT启动子仅在肿瘤细胞中才有驱动活性。3.Tumstatin基因在肝癌细胞HepG2中特异地表达、分泌，在正常肝细胞L-02中无表达；4.含目的蛋白Tumstatin的条件培养

4、基CM-T抑制了HUVEC细胞的增殖，抑制率达(56.49±0.33)%;5.HUVEC细胞在添加了条件培养基CM-T的基质胶上形成的管样分支数为(3.33±1.53)%;CM-T与不含目的蛋白的条件培养基CM-N、CM-NT相比显著抑制了HUVEC细胞血管结构的形成【(3.33±1.53)%vs(24.44±3.11)%、(23.94±2.92)%，P<0.01)】。结论：phTERT-tumstatin质粒构建成功，选择性在肝癌细胞内表达和分泌的目的蛋白能明显抑制血管内皮细胞的增殖和血管结构的形成，对正常肝细胞几乎无影响，具有靶向抑制血管形成的效应。关键词：hTERT启动子;肿

5、瘤抑素；肝细胞癌；基因治疗;抗血管生成;IGeneratedbyUnregisteredBatchDOCTOPDFConverter2010.2.301.1358,pleaseregister!山西医科大学硕士学位论文ConstructionofthevectorofphTERT-tumstatinanditsantiangiogeniceffectAbstractUnlimitedproliferationofhepatomacellsandthecontinuousformationofnewbloodvesselsareimportantreasonswhicharediff

6、iculttoeffectivelycontroltheHepaticcarcinoma.Hepatomacelltelomeraseactivationisthebasisoftheirunlimitedproliferation.StudyconfirmedthatlivercancercellswithhighexpressionoftelomeraseactivityfromthehTERT(humantelomerasereversetranscriptase)genepromoterinthefullyopen.Angiogenesisisthekeyprocesses

7、oftumorsurvivalandmetastasis.Targetedinhibitionoftumorangiogenesismayindirectlyinhibittumorgrowthandmetastasis.HCCisahighlyvascularizedtumor,therefore,usingitsspecifichTERTpromoter-drivenanti-angiogenicgenestoinhibitliverangiogenesisisa