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1、抗冻基因CBF2表达载体构建及转化紫花蓿摘要:以拟南芥基因组DNA为模板,用PCR方法扩增目的基因,连接到PGEM-TEasyVector载体上构建成克隆载体T-CBF2。用BamHⅠ和SacⅠ分别对克隆载体T-CBF2和植物表达载体PBI121进行双酶切,获得目的片段和线性质粒。在T4DNA连接酶的作用下进行定向连接,构建成植物表达载体P-T-CBF2。采用直接转化法将重组子导入根癌农杆菌EHA105。关键词:抗冻基因CBF2;载体构建;农杆菌;紫花苜蓿;转化正文：CBFs(冷诱导基因)由一个小的基因家族编码,包含3个成员CBF1、CBF2和
2、CBF3,3个基因都聚集在拟南芥的4号染色体短臂上,紧密连锁在一起,均可在冷胁迫下迅速诱导表达。CBF这一冷驯化关键调节基因的发现,对植物逆境胁迫生理和抗逆植物基因工程研究产生了一定影响。CBF在植物中是相当保守的,即使是对冻害敏感的番茄(Lycopersiconesculentum),也存在具功能的CBF基因。另外,过量表达CBF除了提高拟南芥(Arabidopsisthaliana)抗冻能力外,也增强了拟南芥对干旱和盐的抗性,因此CBF可作为农作物抗逆基因工程的重要基因。苜蓿，为温带地区重要的牧草,是重要的饲料农作物,低温是制约其生长的限制
3、因子之一,因此抗冻基因导入苜蓿是具有重大的生态效益和经济效益的。期待通过CBF2单基因的导入显著提高苜蓿对低温的适应能力,使优良苜蓿在高寒气候区的种植成为现实,也为今后转化其他经济作物,利用CBF2基因综合改良这些作物的抗逆性奠定基础。1．材料与方法 1.1供试材料：和田苜蓿(Medicagosativacv.Hetian)；大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105、PBI121载体;质粒pGEM-TEasyVector限制性内切酶、T4DNA连接酶及高保真D
4、NA聚合酶。1.2.CBF2基因组DNA的提取用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)法[8],略加修改。取培养15d的拟南芥无菌苗。（1)称取200mg叶片,在液氮处理下,在研钵中研磨成粉末状。（2)2mL离心管中加入800μL65℃预热的CTAB提取缓冲液、80μL无水乙醇,颠倒离心管,使叶片粉末与提取缓冲液充分混合均匀,置于65℃恒温水浴中30min,每隔5min颠倒离心管数次。（3)30min后取出离心管自然冷却至室温,4℃12000r/min离10min。（4)吸取上层清液于另一离心管,加入等体积的氯仿,颠倒混匀,在室温下12000r/mi
5、n离心10min。(5)转移上层清液至另一新的离心管中,加入2倍体积冰预冷的无水乙醇,轻轻混匀。于-20℃下放置30min,使DNA充分缠绕成团。（6)将上述有絮状沉淀的DNA离心,4℃12000r/min,离心10min,倒掉上清液。（7)挑取絮状沉淀,加入70%乙醇清洗2次。风干,最后加入100μLTE(10mmol/L,pH8.0Tris-HCl,1mmol/LEDTA)缓冲液充分溶解DNA沉淀。（8)-20℃下贮存备用。1.3 PCR(polymerasechainreactoin,聚合酶链式反应)根据GeneBank的CBF2cDNA
6、已知序列,设计合成1对引物[9,10],并根据构建植物表达载体的需要在引物5′端分别引入了BamHⅠ和SacⅠ的酶切位点。正向:5′-GCGGATCCATGAACTCATTTTCTGCCTTTTCTG-3′,反向:5′-GCGAGCTCTTAATAGCTCCATAAGGACACGTCA-3′,以CBF2基因组DNA为模板。反应程序:94℃3min→(94℃30s→57℃30s→72℃1min)30(此步骤为30个循环)→72℃10min。热启动法加酶。所用酶为TaqPlusDNAPolymerase(Taq+Pfu)PCR仪为MiniCycle
7、rTM(基因扩增仪)。1.4 目的片段的纯化回收对PCR产物开展琼脂糖凝胶电泳,用DNA快速纯化回收试剂盒回收目的片段具体操作按产品说明书进行。1.5 克隆载体的构建所用载体为PGEM-TEasyVector(T载体系统),该载体专为PCR产物的克隆而设计,具有氨苄青霉素抗性标记,可以进行蓝白筛选,便于进行酶切鉴定和测序。连接反应体系:3μL纯化后的PCR产物+2μL10×LigationBuffer(连接缓冲液)+1μL(50mg/L)PGEM-TEasyVector+1μLT4DNALigase(连接酶)。在16℃条件下连接过夜。1.6 感
8、受态细菌的制备及转化感受态细菌的制备:（1)在LB(培养基)平板上挑取新活化的大肠杆菌DH5α接种于5mLLB液体培养基中,37℃280r/min震荡
