galectin-9及其受体tim-3在哮喘小鼠肺组织中表达及作用

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1、摘要Galectin．9及其受体Tim．3在哮喘小鼠肺组织中的表达及作用硕士研究生：张志英导师：栾斌专业：儿科学郑州大学第三临床医院河南郑州450052要哮喘是一免疫失衡性疾病，UPT淋巴细胞控制着炎症反应，Thl／Th2反应性失衡，Th2型细胞免疫应答异常增高，Thl型细胞免疫应答减弱在哮喘的发病过程中起着关键作用，此平衡失调被认为是哮喘发病的重要机制。糖皮质激素的应用巨大的改变了哮喘患者的临床症状及生存质量，成为支气管哮喘治疗的经典用药。然而，长期应用尤其在大剂量应用时具有明显的毒副作用；对少数重症哮喘患者

2、可能存在对糖皮质激素治疗不敏感或是抵抗。因此人们一直为更有效的治疗哮喘寻求新突破，在变应性疾病中半乳糖凝集素一9(Galectin．9)和T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子一3(Tim一3)在转录水平和蛋白水平都有明显升高，并且其改变与Thl／Th2细胞因子含量有直接关系，它们与变应性炎症过程密切相关。因此本研究探讨性的把Galectin一9及特异性表达于Thl细胞表面的Tim．3分子作为免疫调节的靶分子，通过免疫调节使哮喘中Thl／Th2反应失衡恢复平衡，以期能为哮喘发病机制研究与临床治疗提供理论和实验基础。目的本实

3、验通过建立小鼠哮喘模型，探讨Galectin．9及其受体Tim．3在哮喘小鼠肺组织中的表达及过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR．Y)激动剂罗格列酮(ROS)对其表达的影响，并与Thl／Th2细胞因子进行相关性分析，探讨Galectin-9及Tim．3对Thl／Th2平衡的影响机制。摘要材料和方法1动物分组和模型制作方法清洁级BALB／cdx鼠45只，雌性，5-8周龄，体重18．229，购自郑州大学实验动物中心。按随机数字表法分为哮喘组、对照组、ROS干预组，每组各15只。哮喘组小鼠给予I％OVA／AI(OH)

4、3混悬液0．2ml于第1d、7d、14d腹腔注射联合皮下注射致敏，共三次；第21d开始用2％OVA雾化吸入激发，每次30min，每日1次，持续2周；干预组于第28d起在激发fi{f30min给予PPAR-Y激动剂罗格列酮灌胃干预(10mg／kg)，持续1周；对照组用等量生理盐水致敏和雾化吸入，余同哮喘组。卵蛋白、罗格列酮液每次现配现用。2标本处理血清收集：末次激发后24h内，无菌条件下眼球动脉取血，收集外周血O．8ml置于EP管中，4℃静置2h，3000rpm／min离心10min，取上清液分装，于-80。C保

5、存备作ELISA分析。肺组织标本：采血后用戊巴比妥钠(45mg／kg)腹腔注射进行麻醉，迅速开胸，暴露肺脏，观察肺脏大体改变，取左侧肺组织，快速放于液氮中冻存，留作PT—PCR实验用。然后经右心室插管至肺动脉，用生理盐水冲洗后取右肺中叶，置于4％的多聚甲醛溶液中固定24h，依次酒精梯度脱水，常规石蜡包埋，做厚度约51am切片，行HE染色后，光学显微镜下观察肺组织、各级支气管及血管周围炎症细胞的浸润情况。3ELISA检测血清中IL一4及IFN．Y含量实验过程严格参照试剂说明书进行，定吸光度01)450值，以OD值

6、为纵坐标，样品的OD值确定其浓度。4RT．PCR加终止液混匀后立即由自动酶标仪测标准品为横坐标，绘制标准曲线，据将液氮冻存的左肺组织用Trizol一步提取法提取总RNA，并反转录成eDNA，设计引物扩增目的片段。扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，用BandScan5．0凝胶分析软件分别测定Galectin-9、Tim．3和内参GAPDH的灰度值，并以Galectin．9、Tim一3与内参GAPDH的比值作为该小鼠的代表值。H摘要5统计学方法应用SPSSl6．0统计软件包进行数据分析，计量资料用均数±标准差(i±5)表示

7、。多个样本均数的比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD．t检验；各因素间相关性采用Pearson相关分析，以P<0．05为差异有统计学意义。结果1病理学改变小鼠肺组织切片HE染色显示：对照组肺组织结构完整，气管形态规则，粘膜上皮完整，各级支气管、肺泡、血管周围未见有炎症细胞浸润，肺泡形态规则，各支气管平滑肌未见增生，支气管腔内仅有少量分泌物。哮喘组小鼠肺组织切片可见肺内支气管粘膜下及血管周围有较多EOS浸润，粘膜下充血水肿，粘液腺增生，气道上皮细胞的脱落和上皮组织多处断裂，支气管腔内和肺问质处可见大量分泌物和

8、炎性细胞渗出，支气管壁及基底膜可见轻度增厚且形态不规则。ROS组小鼠肺组织仍可见少量炎症细胞浸润等病理改变，但较哮喘组减轻。2ELISA结果哮喘组IL．4含量(564．48±76．17)较对照组(347．55±44．31)、ROS组(483．81±68．36)有不同程度的增高；而IFN．Y含量(371．56±131．49)与对照组(599．21±105．31)、ROS组(398．67±