牛分枝杆菌基因分型技术的建立

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1、摘要目的：建立IS6110．限制性片段长度多态性基因分型技术(IS6110．RFLP)、牛分枝杆菌数目可变串联重复序列(Ⅵ、ITR)基因分型技术及GTG．聚合酶链式反应(GTG．PCR)基因分型技术；评测建立的三种基因分型技术的分辨效果，选择适用于牛结核病分子流行病学调查研究的最佳基因分型方案。方法：选用-q=夏和周边地区菌株19株、哈尔滨兽医研究所、新疆等地的牛分枝杆菌临床分离菌株，以及结核分枝杆菌标准株H37Rv和牛分枝杆菌标准株AF2122／97共计30个样本；用这30个样本对三种方法的分型效果进行评测。结果：(1)

2、牛结核杆菌临床菌株对IS6110．RFLP评测结果显示，该方法对牛分枝杆菌的分辨力有限，不适合作为牛结核流行病学调查的一线方案使用；(2)用30个牛结核临床样本对3组具有不同等位基因多样性(^)的VNTR位点组合的分型情况进行评测，统计数据表明，以h>0．600的12个VNTR位点组合的菌株分辨指数达到0．997，成簇百分比仅为3．3％，可将样本分为29个类型，与同时使用24个VNTR位点组合的分辨能力相当；(3)经过对4组TRS序列的筛选，确定以(GTG)5作为引物对30个样本进行了扩增，经过电泳分析，结果统计、计算得出

3、GTG—PCR法的分辨指数达HGI=0．991，成簇百分比为15．3％，可将上述30个样本分为26个类型，与VNTR法的分辨率相差不人。结论：实验选取的12个VNTR位点组合分型法在分辨能力、实验操作要求等方面均具有很好的优势，推荐作为牛分枝杆菌分子流行病学调查时的一线分型方案；IS6110．RFLP对牛结核临床株的分离效果有限，不适合作为分子流行病学调查研究的～线方法使用；GTG．PCR法在对30个样本进行的基冈多态性分析中取得了较好的分离效果，但其分辨能力仍需要更多的样本来做进一步证实。关键词：IS61lo一限制性片段

4、}==度多态性，数目可变串联重复序列，三核茁酸重复序列，简单序列重复区间，牛分枝杆菌Abstractobjective：Theaimsoftheseworksweretobuildthreetypesofgenotypingmethods：IS6110restrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis0tFLP)，24lociofVariableNumberofTandemDNARepeatsanalysis(VNTR)and(GTG)5-Polymerasechainreactio

5、ntechnology．AftertIIa：t’t0assessandtochoicethebestmethodwhichsuitablefortheepidemiologicalinvestigationofMycobacteriumbovis．Methods：Therewere30tuberculosisstrainsintotal，23isolatedfromOUrlocallaband7donatedfromHarbinVeterinaryResearchInstitute．Usethemtodefinethose

6、3methodsrespectively,andcomparedthediscriminatoryresultsofthesetechnology．Result：(I)TheresultsofthoseclinicalstrainsbyusingIS6llO—RFLPshowsthat,I$6110‘RFLPdon’thaveenoughpowertoidentifythosesamples，wethinkitisnotsuitablefortheepidemiologicaiinvestigationofMycobact

7、eriumbovis．(2)30samplesweresubjectedtothreegroupsofVNTRcompareswithdifferentlocidiversity．TheresultsshowedthatcomparesBwhichcomprise12loci(h>0．600)hadthesamediscriminatorypoweras24lOCidid，whichHGIreachedto0．997．and29strainsbeisolatedfrom30samples．(3)Atier4typesofT

8、RSbeenfiltrated，(G1’GkWaschoseastheprimertOanalyzethose30samplesgenome，wefoundthattheHGIofGTG-PCRhadahighdiscriminatorypower,HGI=0．991，comparedwiththeVN