浙江汉族del表型基因分型方法的建立

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1、浙江汉族DEL表型基因分型方法的建立作者：吴俊杰，洪小珍，马开荣，许先国，傅启华，严力行【摘要】为了快速鉴定DEL表型，建立浙江汉族DEL表型的基因分型方法，根据RHD1227A等位基因序列设计等位基因特异性-聚合酶链反应(allelespecific-polymerasechainreaction,AS-PCR)，用于DEL表型的基因分型。用已知RHD1227A多态性的样本和已知DEL表型的样本评价基因分型方法的灵敏度和特异性。结果表明：在50例RHD1227A阳性和50例RHD1227A阴性的Rh阴性样本中基因分型方

2、法的灵敏度和特异性都是100％；在33例DEL阳性样本和89例DEL阴性的样本中，基因分型方法的灵敏度为100％，有2例样本血清学结果为阴性而基因分型结果为阳性，重新用血清学方法和序列分析方法复核这2例样本，发现2例都是血清学漏检，因而基因分型方法的特异性是100％。结论：设计的基因分型方法可以有效地鉴定浙江汉族Rh阴性人群中的DEL表型。【关键词】DEL表型；RHD1227A等位基因；基因分型　　EstablishmentofGenotypingMethodforDELPhenotypeinZhejiangHanPop

3、ulation　　AbstractInordertoestablishagenotypingmethodforDELphenotypeinZhejiangHanpopulation,anAS-PCRmethodethodbydetecting50RHD1227Apositiveand50RHD1227Anegativeindividuals,thegenotypingmethoddisplayedasensitivityof100%andaspecificityof100%;inevaluationofthemethod

4、bydetecting33DELpositiveand89DELnegativeindividuals,thesensitivityplesedaspositiveusinggenotypingmethod.Afterre-testingthesetplesethodandsequenceanalysis,itethodgavefalsenegativeresultsandgenotypingmethodstillshoinimaltargetDNAconcentrationofthisgenotypingmethodi

5、s8.13ng/μl.Inconclusion,designedgenotypingmethodcanbeusedtoidentifyDELphenotypeefficientlyinZhejiangHanRhnegativepopulation.　　Keyinion公司的IgM和IgG混合的抗D试剂。RhC、Rhc、RhE和Rhe鉴定采用盐水试管法，试剂为Dominion公司的相应单克隆抗体。　　基因分型　　根据RHD基因和RHD1227A等位基因相关序列设计一组特异扩增RHD1227A等位基因的引物：RHDEL-s:

6、5'-GACCAAGTTTTCTGGAAA-3'（位置对应于AJ299028的68-85）、RHDEL-a:5'-CGAGAG-AATTTTGAGCAC-3'（位置对应于AB035185的849-832）。1对特异扩增人生长激素基因429bp的引物作为内对照，HGH-s：5'-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3';HGH-a：5'-TCACGGATTTCTGTTGTGTTT-3'。反应总体积10μl，含模板DNA0.2μl（约含DNA50-60ng），特异性引物终浓度250nmol/L，内对照引物终浓度50n

7、mol/L，MgCl2终浓度1.5mmol/L，dNTP终浓度200μmol/L，Taq酶0.2U（TaKaRa公司产品）。PCR扩增条件：95℃预变性5分钟，然后94℃变性30秒、58℃退火30秒和72℃延伸50秒，循环30次，最后72℃延伸5分钟。产物通过2％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪（Syngene公司产品，英国）观察结果。　　基因分型方法DNA浓度检测下限评估　　将RHD1227A阳性的DNA用BioPhotometer（Eppendorf公司产品，德国）测得浓度，用RHD1227A阴性的DNA作为稀释液，倍比

8、稀释RHD1227A阳性样本。稀释后DNA的PCR产物通过2％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪（Syngene公司产品，英国）观察结果。　　结果　　RHD1227A多态性已知的Rh阴性人群　　在100例Rh阴性人群中，用基因分型方法扩增50例RHD1227A阳性样本，都可扩增得到867bp的特异条带和429bp的内对照条