等位基因特异性pcr技术在del表型基因分型中的

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1、等位基因特异性PCR技术在DEL表型基因分型中的【摘要】目的：建立DEL表型的基因分型方法，用于快速鉴定DEL表型。方法：用RHBox基因分型方法鉴定标本的基因型，用血清学方法确定标本的DEL表型。根据RHD1227A等位基因序列设计等位基因特异性聚合酶链反应(allelespecificpolymerasechainreaction,ASPCR)，用于DEL表型基因分型，结果同血清学的方法作比较，探讨临床应用的可行性。结果：28例RHBox基因分型为RHD-/RHD-的标本，血清学方法、基因分型方法DEL表型鉴定结果均为阴性;在25例RHBox基因分型为RHD+/RH

2、D-或RHD+/RHD+的标本中，用血清学方法检出的11例DEL表型标本，基因分型方法均扩增到867bp的1227A等位基因条带;1例血清学方法阴性，而基因分型方法检测为阳性，后经测序分析证实RHD1227A为阳性，分析此例标本可能为血清学方法漏检。这说明在鉴定DEL表型的方法中基因分型方法比血清学有更高的灵敏度。结论：ASPCR方法可用于临床筛选Rh阴性人群中的DEL表型。【关键词】Rh血型DEL表型;RHD1227A等位基因;基因分型　　[Abstract]Objective:ToestablishagenotypingmethodforDELphenotypeofhu

3、manbloodgroupsystem.Methods：ThegenotypeinedbyusinggenotypingmethodofRHBox,andDELphenotypeinedbyserologicalmethod.Anallelespecificpolymerasechainreaction(ASPCR)ethodethod,thefeasibilityofthegenotypingmethodinclinicalpracticesplesethodandgenotypingmethodforDELphenotype.In25RHD+/RHD-andRHD+/

4、RHD+samples,11DELphenotypepositivesamplesethod.HopleethodforDELgenotype.Thissampleinedpositivebysequencinganalysis.GenotypingmethodforDELphenotypehadhighersensitivitythanserologicalmethod.Conclusion：TheASPCRmethodcanbeusedforscreeningDELphenotypeamongthepopulationnegativeofRHDantigen.　　[Ke

5、yl，EDTANa2抗凝，采用试剂盒提取全血DNA(EZBDC血液基因组DNA快提试剂盒,济南泰天和生物科技有限公司)，分装-80℃保存备用。　　1.4RHD基因分型　　采用RHBox基因分型试剂盒(GT，美国)PCR反应总体积9μl，含7μlPCR引物混合液，1μlDNA样品，1μlTaq酶(含0.33～0.5单位)。PCR扩增条件：95℃30s，60℃30s，72℃90s，30个循环后置72℃再延长5min。使用0.5×TBE缓冲液，配制2%琼脂糖凝胶，以10V/cm电泳30min，结果通过凝胶成像仪(FR200A全自动紫外与可见分析装置,上海复日科技)拍照成像。　

6、　1.5RHD1227A基因分型　　采用吴俊杰等[5]的方法根据RHD基因和RHD1227A等位基因相关序列设计一组特异性扩增RHD1227A等位基因的引物(上海生工生物技术公司合成)。RHDels:5′GACCAAGTTTTCTGGAAA3′(位置对应于AJ299028的6885)，RHDela:5′CGAGAGAATTTTGAGCAC3′(位置对应于AB035185的849832)。一对特异扩增人GAPDH基因240bp的引物作为内对照，GAPDHF:5′TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG3′，GAPDHR:5′TCCTTGGAG

7、GCCATGTGGGCCAT3′。总反应体积为10μl，含模板DNA0.2μl，特异性引物终浓度250nmol/L，内对照引物终浓度50nmol/L，MgCl2终浓度1.5mmol/L，dNTP终浓度200μmol/L,Taq酶0.2U。PCR扩增条件：95℃预变性5min，然后95℃30s，58℃30s，72℃50s，30个循环后72℃再延长5min。使用0.5×TBE缓冲液，配制2%琼脂糖凝胶，以10V/cm电泳30min，结果通过凝胶成像仪拍照成像。　　2结果　　2.1Rh表型确定　　通过凝集试