浙江汉族del表型基因分型方法的建立论文

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1、浙江汉族DEL表型基因分型方法的建立论文吴俊杰，洪小珍，马开荣，许先国，傅启华，严力行【摘要】为了快速鉴定DEL表型，建立浙江汉族DEL表型的基因分型方法，根据RHD1227A等位基因序列设计等位基因特异性-聚合酶链反应(allelespecific-polymerasechainreaction,AS-PCR).freelentofGenotypingMethodforDELPhenotypeinZhejiangHanPopulationAbstractInordertoestablishagenotypi

2、ngmethodforDELphenotypeinZhejiangHanpopulation,anAS-PCRmethodethodbydetecting50RHD1227Apositiveand50RHD1227Anegativeindividuals,thegenotypingmethoddisplayedasensitivityof100%andaspecificityof100%;inevaluationofthemethodbydetecting33DELpositiveand89DELnegati

3、veindividuals,thesensitivityplesedaspositiveusinggenotypingmethod.Afterre-testingthesetplesethodandsequenceanalysis,itethodgavefalsenegativeresultsandgenotypingmethodstillshoinimaltargetDNAconcentrationofthisgenotypingmethodis8.13ng/μl.Inconclusion,designed

4、genotypingmethodcanbeusedtoidentifyDELphenotypeefficientlyinZhejiangHanRhnegativepopulation.Keyinion公司的IgM和IgG混合的抗D试剂。RhC、Rhc、RhE和Rhe鉴定采用盐水试管法，试剂为Dominion公司的相应单克隆抗体。基因分型根据RHD基因和RHD1227A等位基因相关序列设计一组特异扩增RHD1227A等位基因的引物：RHDEL-s:5'-GACCAAGTTTTCTGGAAA-3'（位置对应于AJ

5、299028的68-85）、RHDEL-a:5'-CGAGAG-AATTTTGAGCAC-3'（位置对应于AB035185的849-832）。1对特异扩增人生长激素基因429bp的引物作为内对照，HGH-s：5'-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3';HGH-a：5'-TCACGGATTTCTGTTGTGTTT-3'。反应总体积10μl，含模板DNA0.2μl（约含DNA50-60ng），特异性引物终浓度250nmol/L，内对照引物终浓度50nmol/L，MgCl2终浓度1.5mmol/L，dN

6、TP终浓度200μmol/L，Taq酶0.2U（TaKaRa公司产品）。PCR扩增条件：95℃预变性5分钟，然后94℃变性30秒、58℃退火30秒和72℃延伸50秒，循环30次，最后72℃延伸5分钟。产物通过2％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪（Syngene公司产品，英国）观察结果。基因分型方法DNA浓度检测下限评估将RHD1227A阳性的DNA用BioPhotometer（Eppendorf公司产品，德国）测得浓度，用RHD1227A阴性的DNA作为稀释液，倍比稀释RHD1227A阳性样本。稀释后DNA的PC

7、R产物通过2％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪（Syngene公司产品，英国）观察结果。结果RHD1227A多态性已知的Rh阴性人群在100例Rh阴性人群中，用基因分型方法扩增50例RHD1227A阳性样本，都可扩增得到867bp的特异条带和429bp的内对照条带，即结果都为阳性；扩增50例RHD1227A阴性样本，都只能扩增出429bp的内对照条带，即结果都为阴性。这表明基因分型方法在该群体中检测RHD1227A的灵敏度和特异性都为100％。电泳图见图1。DEL表型已知人群的Rh阴性人群在122例DEL表型已知

8、的人群中，用基因分型方法扩增33例DEL表型阳性样本，结果都为阳性，扩增89例DEL表型阴性样本，结果有2例（RhCedee）为阳性，87例为阴性。用原始的DEL表型鉴定结果做参照，基因分型方法在该群体中检测DEL表型的灵敏度为100％，特异性为97.75％。血清学方法和基因分型方法结果不一致样本对DEL表型血清学方法检测结果为阴性、基因分型检测结果为阳性的2例样本重新取样分析。血清学吸收释放结果为