鸡干扰素α、γ在昆虫细胞中的共表达

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1、河南农业大学2010届硕士毕业论文摘要干扰素(Interferon,IFN)是多功能细胞因子家族中的一员，是一类高活性多功能的糖蛋白，随着分子生物学及DNA重组技术的迅速发展，已经应用基因工程技术为人类抗肿瘤、抗病毒生产出大量高效的干扰素。本研究以鸡为研究对象，克隆出了鸡干扰素a和丫全基因，然后亚克隆到昆虫细胞／杆状病毒表达载体中，并对其在细胞中的表达进行了初步研究。主要内容包括：1．参照GenBank发表的鸡干扰素a和Y基因序列，分别设计引物，提取淋巴细胞总RNA，进行反转录．聚合酶链反应(RT．PCR)扩增，然

2、后克隆到pGEM．TEasy载体上，经PCR，酶切鉴定和序列测定，证明克隆出的片段为鸡干扰素仅和Y基因。与网上的其他物种干扰素基因进行序列比较，再次证明其为正确的鸡干扰素a和Y基因。2．为了在杆状病毒表达载体中表达鸡干扰素Or,和Y基因，分别设计引物，将编码鸡干扰素a和丫的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual中，分别置于pH和PIO启动子控制下，获得重组质粒pFB．CG。并且在鸡干扰素成熟肽序列之前引入蜂素信号肽替代了原有的信号肽，以期达到鸡干扰素Q和丫蛋白的分泌型表达。为便于重组蛋白的检测

3、和应用镍亲和层析柱进行纯化，在表达基因的C端融合6xHis标签。3．转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DHl0Bac，发生转座作用，经抗性及蓝白斑筛选得到含鸡干扰素a和Y基因的重组质粒rDHIO—CG。然后将重组质粒转染昆虫细胞，SDS．PAGE可检测到分子质量为18．20KDa的多条重组蛋白，实时荧光PCR表明鸡干扰素a和7：在mRNA水平上获得了的表达。结果表明，鸡干扰素a和Y基因在昆虫细胞中得到正确表达。综上所述，本研究成功克隆出了鸡干扰素a和1，全基因，并在昆虫细胞／杆状病毒表达系统中进行了表达，为进一

4、步研究鸡干扰素研叶功能性蛋白作为佐剂对各种疫苗免疫的促进作用及作为治疗剂在临床上治疗病毒性疾病方面的研究奠定了基础。关键词：鸡干扰素q；鸡干扰素丫；克隆；昆虫细胞；共表达5河南农业大学2010届硕士毕业论文Co—expressionofChickenInterferonQand丫inInsectCellsSupervisor：Prof．CuiBaoanMasterCandidate：WangZhenyaAbstract：Interferon(Interferon，IFN)isoneofmultifunctional

5、cytokine，amemberofhighlyreactivemultifunctionalglycoprotein。WiththerapiddevelopmentofmolecularbiologyandrecombinantDNAtechnology，ithasbeenappliedtohumananti—tumor，anti—viruswimgeneticengineeringtechnologytoproducealargenumberofhi曲lyeffectiveinterferon．Inthisst

6、udy，chickeninterferonaand丫geneswereclonedandthensubclonedintotheinsectcell／baculovirusexpressionvector，itsexpressionintheinsectcellsWasstudied．Themaincontentsinclude：1．Primersweredesignedaccordingtochickeninterferonaand丫genesequencespublishedinGenBank．Thechick

7、eninterferonaand丫eDNAwereamplifiedbyRT—PCRfromtotalRNAextractedfromspleenlymphocytes，ThentheamplifiedeDNAwasclonedintopGEM—TEasyvector．ByidentificationofplasmidbyPCRandenzymedigestion，positiverecombinantstrainsweresequenced．DNAsequencingresultshowedthatthesequ

8、enceofchickeninterferon0【and丫werecorrect．ComparetotheinterferonIXand丫sequenceofotherspeciesreportedinNCBI，itWasalsoprovedtobechickeninterferonIXand丫genecorrectly．2．Toexpresschicken