绿色荧光蛋白和成肌调节因子在骨髓基质干细胞中的共表达

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1、绿色荧光蛋白和成肌调节因子在骨髓基质干细胞中的共表达作者：李美山，张成，陈松林，于美娟，张雅妮，王淑辉，熊符【关键词】腺病毒CoexpressionofbothgreenfluorescentprotEinandmyogenicregulatoryfactorsinbonemarroesenchymalstemcells　　【Abstract】AIM:Toinvestigatethetransfectionofbonemarroesenchymalstemcells(MSCs)byrebinantadenovirus(Ad),andthe

2、expressionsofbothgreenfluorescentprotEIn(GFP)andmyogenicregulatoryfactors,etry(FCM).AdGFPplifiedandidentifiedtotransfectMSCs.ExpressionsofbothMyoDandMyogeninyoblasts,andMyoDexpressionmunofluorescence(IF).RESULTS:FCMshoultipleofinfection(MOI),transfectionrateyogenicregulat

3、oryfactorsyogenicdifferentiationofMSCs.　　【Keyesenchymalstemcells;adenovirus;greenfluorescentprotein;C2C12;MyoD;Myogenin　　【摘要】目的：研究重组腺病毒（Ad）对骨髓基质干细胞（MSCs）的转染，以及绿色荧光蛋白（GFP）和成肌调节因子MyoD和Myogenin在MSCs中的表达.方法：用差速贴壁法体外培养大鼠MSCs，并用流式细胞仪（FCM）检测其表面标志；对构建有绿色荧光蛋白的重组腺病毒（AdGFP）进行扩增和鉴定，并

4、转染MSCs；用RTPCR检测MyoD和Myogenin在转染后MSCs中的表达；将MSCs与C2C12成肌细胞共培养，诱导前者的分化，并用免疫荧光检测MyoD的表达.结果：FCM检测证实，在MSCs的表面标志中CD11b和CD45阴性，而CD29和CD44阳性；随着AdGFP感染复数（MOI）的增加，转染效率也相应提高，但在MOI大于100后，MSCs开始出现病变；RTPCR结果提示MyoD和Myogenin在转染后的MSCs中有表达；免疫荧光检测证实诱导后的MSCs可以表达MyoD蛋白.结论：MSCs可以被AdGFP有效转染而表达GF

5、P；同时内源性成肌调节因子的激活，可以促进MSCs的成肌分化.　　【关键词】基质干细胞；腺病毒；绿色荧光蛋白；C2C12；MyoD；Myogenin　　0引言　　骨髓基质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）具有向成骨、脂肪、神经以及肌肉等多种类型细胞分化的潜能，其易于分离和扩增的特性，使其成为细胞治疗的一种很有前景的治疗手段［1-3］.为促使MSCs更好地定向分化，对其进行外源性基因修饰和/或内源性基因的激活，成为目前亟待解决的问题.我们通过构建有绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP

6、）的５型重组腺病毒（AdGFP）转染大鼠的MSCs，并与C2C12成肌细胞共培养，通过激活内源性成肌调节因子，启动MSCs的成肌分化.　　1材料和方法　　1.1材料DMEM和1640培养基（Gibco公司）、胎牛血清（杭州四季青公司）、新生牛血清（Hayclone公司）、FITC荧光标记小鼠抗大鼠抗体（PharMingenandSerotec公司）、人胚肾293细胞和AdGFP（中山大学黄文林教授惠赠）、C2C12细胞（中山大学潘秋辉博士惠赠）、兔抗MyoD多克隆抗体（SantaCruz公司）、山羊抗兔cy3IgG二抗（chemicon公

7、司）.健康雄性SD大鼠，清洁级，质量50~70g，购于中山大学实验动物中心.　　1.2方法　　1.2.1大鼠骨髓MSCs的体外分离培养及鉴定将SD大鼠引颈处死后于无菌条件下分离出股骨和胫骨，用注射器冲出骨髓后，再经吹打制成单细胞悬液.离心后弃上清，用加有胎牛血清（FCS）的DMEM重悬细胞，接种于培养瓶中培养2~3d后换液.约1~2in，再以PBS清洗，多聚甲醛固定，流式细胞仪（FCM）检测MSCs的表面抗原.　　1.2.2293细胞的培养、AdGFP的扩增、纯化、滴度的测定及鉴定将293细胞培养在含100mL/L新生牛血清的1640中培

8、养约48h，细胞生长至80%融合时传代培养.当细胞生长至90%融合时，可用于AdGFP的扩增.弃去培养基，加入AdGFP，再加含50mL/L新生牛血清和35g/L精氨酸的1640培养36~48