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1、鸡Y-干扰素基因的克隆与鉴定程坚吴艳涛彭大新刘秀梵*张如宽(扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室225009)CloningAndIdentificationOfTheChickenInterferon-YGeneChengJianWuYantaoPengDaxinLiuXiufan*ZhangRukuan(AnimalInfectiousDiseaseLaboratory,YangzhouUniversity)干扰素是动物机体内复杂的免疫网络中起调节作用的重要细胞因子之一。在体内广泛参与免疫调节及炎症反应等生物过程，具有T•分重要的生理功能。口前已有一
2、大批人和动物的干扰素基因被克隆。以重组干扰素作为免疫调节剂及基因治疗剂已显示出广泛的应用前景，成为重要的学科增长点之一。尽管首先被发现的干扰索是鸡源干扰索，但对于家禽干扰索的研究，尤其是分子生物学方面的研究，要远落后于对人和哺乳动物干扰素的研究。由于进化的关系，不同种屈来源的干扰素在核营酸和氨基酸水平上均存在一定的差异，人和哺乳动物的干扰素并不能作用于家禽，因此有必要深入开展对家禽干扰素的研究，为控制畜禽传染病提供新手段。1995年Digby成功克隆了鸡Y-干扰索(IFN-Y)基因。木研究旨在应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增和克隆鸡TFN-Y基
3、因,为进一步研究鸡TFN-Y基因的功能及其在控制家禽传染病方面的应用打下一定的基础。1材料和方法1.1引物的设计与合成根据已发表的IFN—基因设计上、卜.游引物P1、P2o上、下游引物5'端分别加SalI和HindIII酶切位点,以便于PCR产物克隆。引物序列如下：上游引物P1,下游引物P2。P1为5'-3'P2为5'GTAGTCGACATGACTTGCCAGACTTACAACGCGAAGCTTCATTAGCAATTGCATCTCCTC-3'1.2鸡脾淋巴细胞的培养无菌手术取鸡脾脏，将脾脏置于5mL磷酸盐缓冲液中，以一直针头和一弯曲针头挤压出脾细胞。将细胞悬
4、液置于淋巴细胞分层液之上，于室温672g离心20min,收集位于界面的淋巴细胞，进行细胞计数，根据计数结果，调整细胞在脾淋巴细胞培养液中至合适浓度，然后置于41°C,5%C02下培养16ho1.3脾淋巴细胞总RNA的提取按TRlzolReagent(GibcoBRL产品)说明书，提取鸡脾淋巴细胞总RNA。1.4与IFN-vmRNA互补的单链DNA的合成在一无菌、经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的指形管中混合细胞总RXA2g(5L)和引物P2400ng(2L),65°C变性5min,迅速冷却至0°C,再F25°C温育15min,使RNA与引物退火。然后依次加入
5、5L5€*AMVBuffer、2L10mmol/LdTP、25URnasin和15UAMV,补充经DEPC处理过的水至总休积为25L,于42°C温育1.5h。1.5聚合酶链式反应扩增IFN-Y基因取上一步反转录产物5L,依次加5L10€*PCRBuffer、1L10mmol/LdNTP、引物Pl400ng(2L)、引物P2200ng(lL)、1L25mmol/LMgC12和水33.5Lo95°C变性5min后，再加入0.5LTaqDNA聚合酶。覆盖石腊油进行PCR反应。共进行30个DNA扩增循环，每个扩增循环的反应条件为：94°C变性45s,54°C退火1
6、min,72°C延伸1niin30s,最后一个循环72°C延伸10min。取5LPCR产物进行凝胶电泳分析。1.6鸡IFN-基因的克隆经琼脂糖凝胶电泳纯化的PCR产物，用琼脂糖凝胶冋收试剂盒冋收。冋收的PCR产物经限制性内切酶SalI、HindIII消化,与同吋经SalI、HindIII消化的质粒PUC18相连。连结产物转化大肠杆菌DH5。涂布含Amp、IPTG、X-gal的LB平板。37°C培养18~20h。挑取白色菌落，小量提取质粒，酶切筛选插入外源片断大小与设计相符的重组质粒。1.7序列测定重组质粒位于SalI和HindTTT位点间的插入片段序列由宝生
7、物工程(大连)有限公司测定。2结果与分析2.1PCR产物的大小在选定的PCR扩增条件下，经ConA刺激的鸡脾脏细胞，从引物Pl、P2扩增出0.5kb特异性条带,与预期相符。123图1PCR产物电泳图谱分析Fig.1AgroseGelAnalysisofPCRProduct1.MakerXVII,500bpLadder2.PCRProduct3.PCRProduct2.2重组质粒的鉴定重组质粒经SalT和HindTTT酶切后，有2.7kb和0.5kb两条带,与预期相符。序列测定重组质粒位于Sal1和Hind111位点间的插入片段的序列测定结果与已发表的鸡IFN
8、—序列完全一致。3讨论1FN-是由抗原或丝裂原激活的
