牛γ干扰素单克隆抗体的制备与鉴定

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1、单锋丽：牛Y干扰素单克隆抗体的制备与鉴定牛丫干扰素单克隆抗体的制备与鉴定研究生：单锋丽导师：焦新安教授陈祥副教授摘要IFN．Y(又称免疫干扰素、II型干扰素)是细胞免疫应答的主要介导者，在抗原或者非特异性有丝分裂原的刺激下主要由固有免疫系统的NK细胞和NKT细胞，以及获得性免疫应答系统的CD8+和CD4+Thl效应T淋巴细胞分泌。IFN-y具有抗病毒和胞内感染、抗肿瘤和广泛的免疫调节活性等广谱且复杂的生物学功能。IFN．Y在调节免疫应答，特别是防御胞内菌感染的Thl型免疫应答的诱导和维持方面起着重要作用。分泌IFN．丫的T淋巴细胞的出现是Thl型免疫应答的特征性表现，通常把生物样本

2、中IFN．丫的水平、或者合成IFN．丫细胞总量作为进行性Thl型免疫应答的指示器。因而，定性或定量检测生物样本中IFN．丫的水平可以反映胞内感染(比如分枝杆菌、李斯特菌、衣原体等病原感染)情况。高特异性的、与天然BolFN一7(bovineinterferon．gamma，牛丫干扰素)反应的BolFN—y单克隆抗体可以作为配体纯化天然BolFN吖和各种重组BolFN-y、作为研究工具来研究牛IFN叫生物学活性和体内免疫调节作用，或者依此建立各种免疫学检测方法(如抗原捕获ELISA、ELISPOT、Immuno．PCR、ICC等)来检测生物样本中BolFN．丫的水平，从而评价机体细胞

3、免疫状态，以及诊断或辅助诊断疾病(如结核病、副结核病等)。为此本研究制备出了高特异性、与天然BolFN．丫反应的BolFN-y单克隆抗体，为上述研究奠定了最基本的物质基础。以纯化的rHis．BolFN吖为免疫原免疫6周龄BALB／c小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合，以rGST-BolFN．丫为检测原，用间接ELISA方法筛选阳性克隆，经3次亚克隆后，共获得30株稳定分泌针对原核表达BolFN-y蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为184、1D2、1D5、1E7、1G5、lH2、1H5、284、2812、2D7、2D8、2E2、2E3、2G5、3A8、3A10、3C12、

4、3E3、3E9、3F1、3F2、4C8、4D3、588、5F5、6C7、6E8、7A6、7D10和7E5。扬州大学硕士学位论文亚类鉴定结果显示184、1D2、1D5、1E7、1H2、2812、2D7、2D8、2G丈≥℃12、3E3、3F1、3F2、4C8、4D3、5F5和6E817株单抗为IgGl，1G5、1H5、284、2E2、2E3、3A8、3A10、3E9、588、7A6和7E511株单抗为IgG2a，6C7和7D10两株为IgG2b。间接ELISA测定效价结果显示，除1H2和3F1上清效价为l：1280，588为1：2560较低外，其他27株单抗上清效价均在lxl04-8x

5、104之间，30株单抗腹水效价均在2×106-1．6×107之间。在Westernblotting分析试验中，184、1D2、1E7、1G5、1H2、1H5、2812、2D8、2E2、2E3、2G5、3E3、3E9、4D3、588和6C7等16株单抗均与23KDarHis．BolFN吖和43KDarGST-BolFN吖重组蛋白发生反应，出现特异性条带。以BolFN．丫标准品为抗原的间接ELISA显示，184、1D2、1E7、1G5、1H2、2812和2D87株单抗细胞培养上清OD值较低，近于阴性；1D5、1H5、284、2D7、2E2、2E3、2G5、3A8、3A10、3C12、3

6、E3、3E9、3F1、3F2、4C8、4D3、588、5F5、6C7、6E8、7A6、7D10和7E523株均呈明显的阳性反应。特异性试验结果显示，大部分单抗与rHis．CerlFN吖(cervusinterferon—gamma，梅花鹿Y干扰素)具有交叉反应，除此之外，单抗只与BolFN-丫发生反应，30株单抗均不与原核表达的其他除rHis．CerlFN．丫以外的重组细胞因子及对照菌反应。以重组杆状病毒Bacmid．preBolFN吖转染Sf9细胞，利用间接免疫荧光试验鉴定30株单抗是否与杆状病毒表达载体系统表达的rBac．BolFN吖反应，结果显示，184、1D2、1E7、28

7、12、2D8、4D3、588、5F5和7D109株单抗未出现明显荧光呈阴性反应；1D5、1G5、1H2、1H5、284、2D7、2E2、2E3、2G5、3A8、3A10、3C12、3E3、3E9、3F1、3F2、4C8、6C7、6E8、7A6和7E521株单抗在细胞膜上均有明显特异性荧光，与rBac．BolFN吖呈阳性反应。收集PWM刺激牛全血的含天然BolFN．Y的血浆以阻断ELISA(InhibitionELISA)方法鉴定30株单抗，结果显示，1G5、1H2、1