绿脓杆菌外毒素a基因的密码子优化、脱毒改造与其特性的研究

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1、摘要绿脓杆菌外毒素A(Pseudottlona$aeruginosaexotoxinA，PEA)是由假单胞菌属绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)分泌的一种细胞毒性外毒素，是绿脓杆菌重要的致病因子。PEA的ADP一核糖基转移酶活性能使靶细胞的延伸因子-2(EF-2)发生核糖基化而失活，导致蛋白质的生物合成受阻，从而对细胞产生毒性作用。利用PEA的这一毒性作用，将其与靶向蛋白(抗体或靶细胞膜受体配基)连接或融合制成的免疫毒素被广泛用于癌症的靶向治疗。PEA除具有上述细胞毒性作用外，还具

2、有较强的免疫原性，它不仅可作为疫苗蛋白，也是一种重要的疫苗佐剂和疫苗载体。然而由于天然PEA的细胞毒性较强，不能直接作为疫苗佐剂和载体应用于疫苗的生产，必须通过基因工程方法对其进行基因改造使其毒性降低或完全脱毒才能应用。为提高PEA基因在大肠杆菌中的表达水平和获得脱毒的PEA基因，我们首先利用PCR方法从本实验室构建的含有PEA基因的pcDNA3．1／PEA质粒中扩增PEA基因，然后依据该基因的序列，利用大肠杆菌偏爱的密码子对PEA编码基因进行了全序列优化改造并人工合成，然后利用pET20b(+)质粒

3、分别构建其与His标签融合的野生型和密码子优化型的PEA原核表达载体pET20b．PEAwt／His和pET20b—PEAopt／His。将表达载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，经IFq'G诱导使其进行分泌表达。采用硫酸镁休克的方法从细菌周质中分离表达的重组PEA蛋白，用Ni—N，I'A琼脂糖进行纯化，通过SDS—PAGE和Western—blot鉴定重组PEA蛋白，用考马斯亮蓝显色法检测PEA蛋白的浓度，并比较野生型和密码子优化型PEA的表达水平。然后以构建好的pET20b-PEAo

4、pt／His质粒为模板，根据PEA蛋白的结构特点，在PEA蛋白的氨基酸序列中选定若干位点，通过核苷酸介导的定点突变方法对选定位点氨基酸的编码基因进行定点突变，从而得到若干PEA突变体的原核表达载体。将各种突变体表达载体转化大肠杆菌进行表达，用与上述同样的方法分离纯化和鉴定重组PEA蛋白。最后利用小鼠成纤维细胞L929检测不同PEA突变体对细胞的毒性作用，从中筛选出毒性低的PEA突变体。实验结果表明，经过密码子优化，PEA编码基因发生402个碱基的取代，GC含量由原来的69．8％降至52．2％，下降了3

5、3．7％。蛋白表达结果显示，密码子优化型PEA的表达量(78．7±2．5mg／L)明显高于未优化的表达量(39．O±2．0mg／L)(P<0．01)，表达水平提高了近1倍。细胞毒性实验表明，密码子优化的PEA基因制备的重组蛋白对培养的动物细胞L929有明显的毒性作用，说明该蛋白具有天然生物活性。经过定点突变得到的12个PEA基因突变体，经SDS．PAGE检测证实不同PEA突变体基因均能在大肠杆菌中进行分泌表达。表达的PEA重组蛋白经Ni．NTA琼脂糖纯化，作用于L929细胞显示出不同的细胞毒性，通过比

6、较得出12个低细胞毒性的PEA突变体，并最终从中选取3个毒性较低的突变体用于下一步的研究，从而为PEA蛋白在疫苗佐剂与载体上的研究和应用奠定了基础。关键词：绿脓杆菌外毒素A；密码子优化；定点突变：脱毒改造；原核表达Studyofcodonoptimization，detoxicafionofPseudomonasaeruginosaexotoxinAgeneanditscharacteristicsGraduateStudent：WangXingxingSupervisor：．Prof．ZhongFe

7、iMajor：．BasicveterinarymedicineAbstractPseudomonasaeruginosaexotoxinA(PEA)isanumberoffamilyofbacterialADP-ribosylatingtoxinsandanimportantcausativeagentofPseudomonasaeruginosa．ItcarlADP．ribosylatetheeukaryoticelongationfactor2(EF-2)oftargetcellsandinhib

8、itproteinsynthesis，resultingincytotoxicitytothehostcells．Basedonitscytotoxicfunction，specifictargetingprotein(antibodyorligandformembranereceptoOlinkedtocytotoxicPEA，calledimmunotoxins，werewidelyusedforCanCel"therapy．Inadditionto