星形细胞瘤血管生成拟态的形态观察与恩度抑制肿瘤与肿瘤血管形成相关分子机制的实验的的研究

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1、长提供良好的灌注；另一方面，血管生成拟态的发生需要破坏组织形成管道，加之缺乏内皮细胞的屏障作用，管壁外衬的肿瘤细胞在释放蛋白水解酶并溶解基底膜后有直接进入血流的可能，因此更有利于肿瘤的侵袭和转移。VM是对传统血管生成理论的重要补充，不仅解释了血管生成理论难以说明的一些问题，而且为抑制肿瘤血液供应提供了新的思路和方法。随后的研究发现，血管生成拟态不仅存在于眼葡萄膜黑色素瘤中，而且同样存在于皮肤黑色素瘤、卵巢癌、炎性乳癌、胃癌、肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤中；VM不仅与肿瘤的生长、侵袭转移等生物学行为有关，而且和疾病的治疗预后密切相关。星形细胞瘤(astrocytoma)是成人脑组织最常

2、见的原发恶性肿瘤，是人体血管化程度最高的肿瘤之一，有明显的血管增殖和生成特性，微血管增殖是星形细胞瘤分级的重要标准。胶质母细胞瘤(glioblastoma)是星形细胞瘤的最高级别(WHOⅣ)，是已知血管化程度最高的非血管源性恶性肿瘤。针对内皮细胞的抗血管药物治疗已经在约50％的星形细胞瘤患者取得效果，但是临床耐药病例却逐渐增多。为了更有效的进行临床治疗，深入研究星形细胞瘤血管生成的分子机制是十分必要的。以往研究已经证实，血管发生和血管新生都参与了星形细胞瘤血管生成，但血管生成拟态是否参与了星形细胞瘤的血管生成，其与星形细胞瘤的治疗预后的关系如何，迄今为止还没有系统的研究。1997

3、年Folkman教授在血管内皮瘤细胞系的条件培养基中发现了一种抗血管新生内源性糖蛋白，称之为内皮抑素(endostatin)。内皮抑素具有强烈的抗血管新生和抗肿瘤作用，很快被应用于临床治疗恶性治肿瘤。然而由于生产提纯非常困难，内皮抑素的临床应用受到限制。恩度(Endostar)是一种重组人内皮抑素，由中华人民共和国食品药品监督局2005年批准用于临床治疗非小细胞肺癌，我国学者在血管内皮抑素的结构上增加了9个氨基酸，成功解决了重组人内皮抑素稳定性差的问题。临床应用及相关研究已经证实恩度具有很强的抗血管新生和抗肿瘤作用，但恩度是否对血管生成拟态有抑制作用未见报道。本实验中我们首先用人

4、组织切片双重染色观察星形细胞瘤是否存在血管生成拟态现象并分析其临床意义；其次，我们在Matrigel上三维培养星形细胞瘤细胞系U251、SHG44，体外观察星形细胞瘤细胞形成VM的能力；最后，研究恩度在2体外对星形细胞瘤细胞的增殖、侵袭及VM的抑制作用，并利用RealtimeRT．PCR和Westernblot技术探讨相关的分子机制。实验方法一、临床病理标本收集收集中国医科大学附属盛京医院病理科1998．2006年诊断的星形细胞瘤病例，选择临床资料完整的石蜡标本共80例。其中弥漫型星形细胞瘤(WHOII)30例，间变型星形细胞瘤(WHOIII)20例，胶质母细胞瘤(WHOⅣ)30

5、例。二、免疫组化和PAS双重染色为了更直观的观察VM结构，本实验设计了CD34与PAS、GFAP与PAS两种双重染色方案。首先按照间接法进行CD34或GFAP免疫组化染色，当DAB显色后，进行PAS染色，再苏木素复染，封片。三、组织切片形态观察及VM的确定光学显微镜下观察双重染色的组织切片。PAS阳性CD34阴性内有红细胞的管腔认定为VM血管，每张石蜡切片5个随机视野(100x)有超过30％的VM血管定义为该患者存在血管生成拟态现象。四、细胞培养共4种细胞，星形细胞瘤细胞系U251、SHG44传代培养，人脐静脉内皮细胞(Humanumbilicalveinendothelialc

6、ells．HUVECs)、大鼠脑星形胶质细胞(astrocyte)原代培养。细胞培养于含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中，在37℃、5％C02、饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，细胞贴壁生长。五、细胞三维培养Matrigel胶4℃过夜解冻，冰上操作，吸取Matrigel胶至96孔培养板，50叫孔，注意勿产生气泡，置37℃培养箱中孵育lh，使其凝固。对数生长期的上述4种细胞，取细胞悬液100m加入已铺胶的96孔细胞培养板，细胞数为lxl04个／孔，培养24h、48h，在倒置相差显微镜下(100x)对细胞小管形成情况进行图像观察及采集。3六、MTT测定细胞增殖情况对数生长期的星

7、形细胞瘤细胞系U251、SHG44，取细胞悬液100斗l加入96孔细胞培养板，每孔约含l×104个细胞，分别用不同浓度的恩度(O，125，250，500，and1000I_tg／m1)作用12h、24h、36h．MTT法测定细胞的增殖情况。七、Transwell测定细胞侵袭能力将用Matrigel包被好的Transwell小室放入24孔板中，下室加入含20％FBS的高糖DMEM培养液250山，加入已稀释的浓度为2000Itg／ml、1000ttg／ml、500ttg／ml的恩度工