gtl2基因在体细胞核移植牛中的印记状态研究

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1、摘要体细胞核移植技术(SCNT)在医学研究、畜牧业生产和拯救濒危动物方面有重要的应用价值，而核移植效率低是制约其应用的主要因素。目前认为：供体核的不完全重编程导致在发育过程中有重要作用的基因没有表达或异常表达是体细胞核移植效率低的主要原因。大多数印记基因在调控胚胎生长和出生后的发育中起重要作用，体细胞核移植动物表现出的发育异常很可能与印记基因表达紊乱有关，但是在体细胞核移植牛中，由于缺少牛印记基因序列以及多态性信息，对印记基因表达的研究较少。Gtl2基因是在人和鼠中己被鉴定的印记基因，它作为一种RNA调解分子调控目的mRNA的转录，在胚胎发育过

2、程中起着重要作用。为了探讨造成体细胞核移植动物新生死亡以及器官发育异常的可能分子机理，我们分析了Gtl2基因在自然繁殖牛和新生死亡的体细胞核移植牛心、肝、脾、肺、肾、大脑6个组织中的表达情况。印记基因表达状态的分析是基于印记基因为单等位基因表达，所以必须首先在亲本等位基因上找到单核苷酸多态性(SNP)，即基因组中单个核苷酸突变引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式。单链构象多态性(SSCP)技术以其可重复性好、快速、简单的特点成为寻找SNP最常用的方法之一，本研究应用PCR．SSCP方法对牛Gtl2基因的多态性进行分析

3、。首先，根据己发表的羊Gtl2基因(AY017220，AY017221，AY017222)与牛的基因序列(XM872590)进行同源性分析，设计3对扩增产物在100b一00bp范围的PCR引物以获得最佳的SSCP结果。进而，应用PCR．SSCP技术分析牛Gtl2基因多态性，并通过测序鉴定自然繁殖牛和体细胞核移植牛中的杂合子。最后，利用RT-PCR．SSCP技术对Gtl2基因在杂合子牛的6个组织中的表达状态进行分析，并通过测序对表达结果进行验证。研究结果表明：G以基因在自然繁殖牛被检测的6个组织中均表现为单等位基因表达，在体细胞核移植牛的心和肝中

4、也表现为单等位基因表达，而在体细胞核移植牛的大脑、脾、肺、。肾4个组织中表现出双等位基因表达。由此可以得出：G以基因表达紊乱有可能是造成体细胞核移植牛器官发育异常和新生死亡的原因之一。关键词：牛；Gtl2；基因组印记；体细胞核移植GenomicImprintingofGtl2inSomaticCellNuclearTransferCattleAuthor：．WangJianChunSupervisors：LiShiJieMajor：．BiochemistryandMolecularBiologyAbstractSomaticcellnuclea

5、rtransfer(SENT)hasgrcatvalueinmedicine，stockbreedingandsavingendangeredanimals，butthelowefficiencyofSCNTrestrictsit’Sapplication．Thelowefficiencyofanimalproductionusingsomaticcellnucleartransferproceduresisconsideredtobetheresultofanincompletereprogrammingofthedonorsomaticce

6、llnucleus，whichleadstoalackof,orabnormalexpressionofdevelopmentallyimportantgenes．Mostimprintedgenesplayimportantrolesinernbryogenesisandpostnatalgrowthregulation．ThedevelopmentabnormalitiesofSCNToffspringareprobablyaresultofabnormalexpressionofimprintedgenes．Howeverimprinti

7、ngstudiesinSCNTcattleremainanunderdevelopedareaofresearch，largelybecauseofthelackofinformationonsequencesandpolymorphismsofputativeimprintedgenesinthebovine．Gtl2isoneofimprintedgenesinhumanandmouse，whichregulatesthetranslationoftargetmRNAasnoncodingRNAsandplaysanimportantrol

8、einregulatingembryogenesis．Inordertodiscussthemolecularmechanismsoftheorgan