手工核移植技术在牛体细胞克隆中的应用研究

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1、西北农林科技大学硕士学位论文手工核移植技术在牛体细胞克隆中的应用研究姓名：万敏申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：张涌20080301手工核移植技术在牛体细胞克隆中的应用研究摘要本试验以牛卵母细胞为实验材料，对脱羰秋水仙碱辅助牛卵母细胞去核的相关条件进行优化。在此基础之上进行了牛手工核移植(又称手工克隆)技术的相关工作，尝试无透明带核移植方法，wows培养体系等。目的在于建立适合本试验室条件的手工核移植体系，并优化该体系，为进一步简化牛核移植技术，降低实验成本完成基础性的工作。1．脱羰秋

2、水仙碱(Deme)诱导牛卵母细胞显核。比较不同显核时间、Deme浓度以及极体形成等因素对牛卵母细胞显核的影响。结果显示：(1)0．5ug／mLDeme处理卵母细胞，诱导1h时获得最高显核率(76．Oo％)，高于O．5h(61．18％)、1．5h(64．10％)和2h(63．46％)组；(2)不同浓度Deme处理成熟卵母细胞lh，O．4ug／mL和O．5ug／mLDeme组显核率(分别为75．24％和77．3l％)较高，显著高于0．3ug／mL组(46．54％)与0．6ug／mL(60．66％)组

3、：(3)O．4ug／mLDeme处理卵母细胞1h，有极体组显核率(83．24％)与无极体组(77．54％)无显著性差异。研究表明，0．4ug／mLDeme处理卵母细胞lh能更好地诱导牛卵母细胞显核。2．分别以传统和手工两种方法对牛卵母细胞进行核移植。(1)比较两种核移植技术涉及的技术步骤及所需的时间；(2)比较盲吸法和脱羰秋水仙碱辅助去核法的去核率；(3)比较传统核移植与手工核移植重构胚的发育情况。结果表明：以100个牛卵母细胞为基准，手工核移植(263～360min)比传统核移植所需的时间(3

4、45～450min)至少短60min。从去核的准确性来讲，脱羰秋水仙碱辅助去核法(98．57％)远高于盲吸法(63．21％)；从总体去核率来看，切割去核法(45．48％)仍高于盲吸法(33．00％)，但两者间无显著性差异。手工核移植的重构胚的卵裂率和囊胚发育率(78．79％和39．5l％)均高于传统核移植组(72．00％和27．78％)，但二者间并无显著性差异。关键词：牛；手工核移植；脱羰秋水仙碱THEAPPLICATIONOFHAND．MADENUCLEARTRANSFERONSONp灯ICC

5、LONINGINCATTLEABSTRACTBased伽boVineoocytes，thisStudym嘲stoexploreamoresuitablesystemfordemecolcine一笛sis_tedenuleationoncattle．FoHowingth砖didsomework0nhand—madenuclear仃ansfer(hand—madec10nin曲onbovine，suchaszona-freenucleartransfer觚dWOWscultureSystemetc．

6、Thepurpo∞ofthisStudyist0setupasuitablesystemof11and—madecIoningforourlaborato叮锄dcompletetheb弱ic、№rkforthesimplificationofnucleartr锄sf．eraIldreductiononthecoStof讥1．Thedemecolcinew部usedtojnducethenucleuseXtrusionsonbovineoocytesiIlthisStudy．Andsomef砬to

7、rsefI’ectingthefomationofnuclearextmsionwere舔sessed，incJudingoocyteswimorwithoutthefiI．stpolarbody'di臻：rentconcentration锄Iddurationofdemecolcine-蜘铋栅lent．而eresultdemonstrated：(1)仃eatedwithO．5∥∥mLdemecolcine，00cytesinducedforlh(76．OO％)gainedhi曲errateof

8、e栅ionthanth0SeforO．5h(61．18％)、1．5h(64．10％)and2b(63．46％)．(2)Andin1hdemecolcine—treatme叽O．4艇-／mL锄dO．5∥咖Ldemec01cinegroupobtajnedthehi曲errateofeXtlllsion(75．24％锄d77．31％respeCtiVely)comparedtotheO．3∥咖L(46．54％)and0．6腭，mLgroup(60．66呦．(3)Andtherew嬲n0s咖ifica