利用体细胞核移植技术生产转基因猪的研究

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1、东北农业大学硕士学位论文利用体细胞核移植技术生产转基因猪的研究姓名：宋军申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：刘忠华20070620摘要转基因动物是目前生物领域的研究热点之一，其通过改变了动物的遗传组成，使动物按照人们的意愿进行改造。以传统的原核显微注射法生产转基因动物的效率非常低下(成功率仅为3~5％)，严重地制约了转基因动物研究进展。与之相比，体细胞克隆技术在生产转基因动物方面有着不可比拟的优越性，成为目前生产转基因家畜的最佳方法。绿色荧光蛋白(GFP)转基因猪研究可以为家猪育种、人类

2、疾病模型和人类异种器官移植研究奠定良好的基础。本实验研究了质粒浓度，脂质体浓度，脂质体一质粒复合物与细胞共孵育时间对GFP转染猪胎儿成纤维细胞效率的影响，通过(3418的筛选，获得稳定表达绿色荧光蛋白基因的阳性细胞，并以此阳性细胞作为体细胞核移植的核供体，以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎，并对重构胚在体外和体内发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。取得如下结果：1．G418筛选浓度为50099／ml，维持筛选浓度为20099／ml，在筛选到30天左右时，可以

3、获得较纯的、能稳定表达绿色荧光蛋白的猪胎儿成纤维细胞；2．原代至3代的PFF。24孔培养板70~900／dC合程度，采用脂质体转染试剂(1ipofe：c--ttransfectionregent)为2．O山、质粒(pEGFP-C1)0．899，复合物作用时间为6h时获得的转染效率最高，转染效率约3．78％；3．GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为11．4％，GFP阳性胚胎率为55．2％；4．重构胚移植于10头受体后，有5头妊娠，3头受体发育到期，共产出克隆猪6头，其中4头为GFP阳性，经DN

4、A检测确认为GFP转基因猪；转基因克隆胚胎移植出生率为1．O％，阳性个体出生率为0．7％。结果表明脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞，获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能。通过体细胞核移植技术生产转基因克隆猪，建立了一套较完善的体细胞传代培养、体细胞转染、阳性细胞筛选和传代、转基因克隆胚胎的生产和移植的生产体系，为今后在猪基因组上进行更深层次的研究打下基础。这是我国的第一批转基因克隆猪，对我国体细胞克隆转基因猪的研究具有重要的参考价值。关键词绿色荧光蛋白；转基因动物；体细胞核移植：脂质

5、体；转染；猪胎儿成纤维细胞VStudiesonproductionoftransgenicporcinebysomaticcellnucleartransferAbstractTransgenicanimalresearchisoneofthemosthotcestspotsinbiology,whichcallchangethegeneticcomponentandproductiveperformanceinanimalaccordingtomankindmind．Theproduction

6、efficienyoftransgenicanimalbythetraditionalmethodofpronucleusmicminjeetionisverylow(Theeffciancyoftraosgeneisabout3~5％．)，whichseriouslyrestrictedthedevelopmentoftransgenicanimalresearch．Incomparisonwiththetraditionalmethod，thistechniqueofsomaticcelln

7、ucleartransferhasmanyadvantageswhenusedintransgenicanimalproduction,SOsomaticcellnucleartransferisthemostpromisedrouteforproducingtransgenicfarmanimal．ResearchonGFPtransgenicpigc锄provideusefulinformationfortransgenicbreedingofpig,humandiseasemodeland

8、humanxenotransplantation．Inthisstudy,Wescreenedtheeffectsoftheconcentrationofliposomeandplasmid，exposuretimeofcellstotheliposome-plasmidcomplexesonGFPgenetransfectionofprocinefetalfibroblasts(PFF)，thengotthepositivecellsexpressingGFPstablyafterselect