食蟹猴—猪异种体细胞核移植初步研究

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1、广西大学硕士学位论文食蟹猴--猪异种体细胞核移植初步研究姓名：梁明明申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：卢晟盛201206食蟹猴一猪异种体细胞核移植初步研究摘要体细胞异种核移植能够解决卵母细胞资源稀缺问题，是治疗性克隆的潜在有力技术。但目前相对于同种核移植胚胎与体外受精胚胎，异种核移植技术效率低下是当前亟待解决的问题。本研究的目的在于为食蟹猴一猪异种核移植胚胎选择有效的融合／激活策略和培养液。本研究的试验方法和结果简述如下：1．为了解食蟹猴．猪异种体细胞核移植胚胎的发育能力，试验

2、以食蟹猴和猪耳部成纤维细胞为供体，猪MII期去核卵母细胞为受体，构建核移植胚胎，重构胚经激活后于PZM．3培养液中培养。结果表明：食蟹猴一猪异种核移植胚胎与猪同种核移植胚胎的分裂率没有显著差异(70．0VS．76．6％，P>o．05)，但食蟹猴．猪异种核移植胚胎不能发育超过16一细胞期。通过食蟹猴和猪特异引物确认食蟹猴．猪异种核移植胚胎和猪同种核移植胚胎的遗传物质均来源于他们各自的供体细胞。2．试验比较了食蟹猴．猪异种核移植、猪同种核移植以及猪孤雌激活胚胎在融合或激活后1h染色质状态的变化。食蟹

3、猴一猪异种核移植胚胎融合后lh的染色体早熟凝集率较猪同种核移植胚胎和猪孤雌激活胚胎显著降低，说明异种核移植胚胎的核重塑不完全。通过使用无钙离子融合液防止卵母细胞预先激活的策略能够显著提高染色体早熟凝集的比例。但无论是融合同时(后)激活，无钙离子液的使用均未能使食蟹猴异种核移植胚胎发育到囊胚期。3．HECM-10是猴类胚胎常用的培养基，为研究这两种培养液对异种核移植胚胎发育的影响，试验将融合后的食蟹猴．猪异种核移植胚胎分别于PZM-3、HECM-10和HECM．10+10％FBS中培养。试验结果发

4、现，食蟹猴异种核移植胚胎在各培养液中的分裂率无显著差异，且均未能发育到囊胚期。本研究结果表明，在本研究条件下，猪卵母细胞能够部分支持食蟹猴体细胞核重塑过程，但其不能支持食蟹猴．猪异种核移植胚胎发育到囊胚阶段。关键词：食蟹猴猪异种核移植胚胎发育核重塑THEPRELI心ARYSTUDYONINTERSPECIESNUCLEARTRANSFERBET、砸ENPORCINEOOPLASMANDCYNOMOLGUSMONKEYSOMATICCEL．LSABSTRACTInterspeciessomatic

5、cellnucleartransfer(iSCNT)providesapotentialsolutiontoovercometheproblemofoocyteshortagefortherapeuticcloning．However,thelowefficiencyofiSCNTembryonicdevelopmentisacrucialproblemwhencomparedtoinvitrofertilization(IVF)andintraspeciesSCNT．Theobjectives

6、ofthisstudyweretochooseeffectiveembryoreconstructionmethodsandculturemediaforinvitroproductionofCynomolgusmonkey—pigiSCNTembryos．Theresultsareasfollow：1．Inthisstudy,monkeyandporcineskinfibroblastswereusedasdonorcellsforreconstructionwithporcineenucle

7、atedoocytes．ThereconstructedembryoswerethenculturedunderPZM-3．Noapparentdifferencewasfoundbetweenmonkey．pig(M／P)一iSCNT,andpig-pig(PP)一SCNTembryosincleavagerate(70．0YS．76．6％，respectively；p>0．05)；．However,MP—iSCNTembryosfailedtodevelopbeyondthe16一cells

8、tages．PCRamplificationofmonkey．．specificandpig--specificmicrosatellitemarkersshowedthattheDNAofmonkeyiSCNTembryosandpigSCNTembryoswereidenticaltothatoftheirdonor．1II2．ChangesinchromatinconfigurationofclonedembryoswereobseP-edbystainingthem，atlhrpost—