体细胞克隆法构建抗乙脑病毒转基因猪胚胎研究

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1、QingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyTangYuanFengCollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicineSupervisor：SongXuexiongQingdao．ChinaJune，2012洫峪曲mK．Ⅱn州断勰始黼恤勰蛔n勘瑚酊∞№衙趾斟似坤故1-L【+L．卜玎吼n吼nmO久叫栅M啪帆驴蚵ybd．nlt1亿E‰E学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在

2、导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特另tl／m以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。如不实，本人负全部责任。学位论文作者签名：意朋签芋日觌彻?海参黾老日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学

3、位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：急扭签字日期：调y年C,9-p乡EI导师签字：签字日期：卅萨6月冲日，＼L厶∥劲、绍介青岛农业大学硕士论文中文摘要体细胞克隆法构建抗乙脑病毒转基因猪胚胎研究摘要猪乙脑病毒又称日本脑炎病毒(JapaneseEncephalitisVirus，JEV)可引起流行性乙型脑炎，是一种重要的人兽共患病，已被世界卫生组织列为需要重点控制的传染病。因此，研究和建立抗乙脑病毒转基因猪新品种具有重要的理论和实践意义。本研究以体细胞核移植技术构建转抗乙脑病毒转基因猪为总体目标，进行了供核细胞的培养、供核

4、细胞的基因转染和转基因重构胚的构建等方面的研究。1．供核细胞的培养。从妊娠大白母猪采取体长10．15cm猪胎儿，采集背部皮肤，用组织块法培养法获得原代培养细胞并进行传代培养，细胞传至第7代，生长状态良好，生长曲线是典型的“S”型，获得了纯化的胎儿成纤维细胞。2．供核细胞的基因转染。外源质粒DNA为携带抗乙脑病毒基因的PGPU6／GFP／Neo质粒载体，基因转染用脂质体Lipofectamine。M2000介导。取第5．7代细胞进行抗猪乙脑病毒质粒DNA转染，当质粒DNA的量设定为0．35、0．7、1．05和1．4嵋时，转染效率分别为12．75％、

5、36．82％、24．12％和8．85％；当脂质体体积设定为0．7、1．4、2．1、2．8和3．59l时，转染效率分别为13．08％、21．71％、37．15％、24．21％和9．21％；当转染时间设定为2．5、4．5、6．5和8．5h时，转染效率分别为3．97％、38．48％、17．54％和12．47％。这些结果表明，2．19l脂质体介导0．799质粒DNA转染4．5h转染效率最高。3．转基因重构胚的构建。采用化学辅助法将37～39h成熟培养的卵母细胞去核为受体细胞，胎儿成纤维细胞为供体细胞注入去核卵母细胞的卵周隙中，然后电脉冲联合6一DMAP融

6、A／激活重构胚。当电场强度设定为1．2、1．5、1．8、2。0kv／cm时，1．5kvlcm组的融合率、卵裂率和囊胚率分别为70．89％、68．75％和16．87％，显著(P<0．05)高于其它试验组；当脉冲时间设定为30、50、801xs，509s组的融合率、卵裂率和裘胚率分别为71．53％、70．82％和56．93％，显著(P<0．05)高于其它试验组，而且死亡率较低(12．22％)；当电脉冲设定为1、2和3DC时，1DC组的融合率、卵裂率扣囊胚率分别为71．5％、63．62％和19．33％，显著(P<0．05)高于其它试验组。这些结果表明，

7、1．5kv／cm、509s、1DC时重构胚的胚胎发育效果最佳。转基因重构胚经过电脉冲联合6-DMAP融合／激活后，获得融合率73．02％、卵裂率66．30％、囊胚率13．11％，获得74．74％P日性囊胚率。青岛农业大学硕士论文中文摘要关键词：猪胎儿成纤维细胞；抗乙脑病毒载体；转基因胚胎；体细胞核移植青岛农业大学硕士论文英文摘要StudyonConstructionofTransgenicPorcineEmbryosAnti—·JapaneseEncephalitisVirusbySomaticCellNuclearTransferAbstrac

8、tJapaneseencephalitisviruscouldcauseencephalitisandbeaseriouszoonosi