dkk1转基因体细胞克隆西藏小型猪的制备硕士论文

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文DKKl转基因体细胞克隆西藏小型猪的制备GenerationofDKKltransgenicTibetminipigsbysomaticcellnucleartransfer(SCNT)课题来源：国家973项目学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会委员刘薇袁进肖东顾为望动物学全日制非定向硕士实验动物中心张丈清陆家海黄俊明吕巡贤张文清董文其2013年5月25日广州教授研究员教授硕士学位论文DKKl转基因体细胞克隆西藏小型猪的制备硕士研究生：刘薇指导教师：袁进副教授肖东研究员顾为望教授摘要研究背景和意义：由于体型小、便于操作，

2、而且解剖、生理生化特性与人特别相近的特点，小型猪已逐渐成为生物医药研究领域重要的实验动物，应用数量逐年大幅递增。西藏小型猪是世界上体型较小的小型猪之一，来源于青藏高原、海拔2500—4300米的农区和办农牧区，是唯一能适应高海拔气候和以放牧为主的猪种，封闭的地理环境使西藏小型猪保存了非常纯正的品种资源。南方医科大学实验动物中心于2004年将西藏小型猪从西藏引进至广州进行实验动物化研究，目前已完成风土驯化及实验动物化研究，并开展了相关动物模型、药物试验及转基因克隆等研究。从免疫学、遗传学等研究发现，该品系具有其独特的免疫相关指标和遗传特征，加1l二其独特的外形，是一种优良的实验用小型猪品系。小

3、型猪的皮肤系统与人的有较大的相似性，故被认为是皮肤相关研究的理想模型猪和人的皮肤均由表皮、真皮、皮下组织三层组成；猪的皮肤在解剖结构、形态、生理生化特性与药理学等方面与人的非常相似，包括皮肤厚薄(如小型猪皮肤70—140微米厚，人皮肤50—120微米厚，而大鼠皮肤10—20微米厚)、皮肤形态学和增生动力学、皮肤修复再生性、烧伤皮肤的体液和代谢变化规律等。因此，猪被认为是皮肤和整形外科手术的标准模型，也是进行皮肤移植、化妆品安全性评价、紫外线照射、皮肤致癌、烧伤、冻伤、皮肤的老化及抗老化等研究的理想实验材料。但是，猪皮肤表面被毛，在对小型猪进行皮肤实验或外科手术之前，总是免不了繁琐的剃毛程序。

4、常见的无毛小型实验动物有裸鼠、豫医无毛小鼠和无毛豚鼠，其中无毛豚鼠已被广泛应用于皮肤相关研究(如生发剂疗效、皮肤过敏反应、植皮治疗、紫外线辐射反应等)。目前，世界上仅有的一种无毛猪品系为尤卡坦(Yucatan)小型猪，也叫墨西哥无毛猪，广泛应用于皮肤研究。目前，我国已培育了许多小型猪品系：包括五指121d,型猪、贵州小型猪、广西巴马小型猪、版纳微型猪和西藏小型猪等，尚未培育出无毛小型猪品系，而生物医学研究急盼基于中国培育的小型猪品系创制无毛小型猪新品系。创制无毛小型猪品系，将免除相关实验过程中繁杂的脱毛程序和由此造成的皮肤损伤，无毛小型猪可广泛用于皮肤移植、化妆品安全性评价、紫外线照射、皮肤

5、致癌、烧伤、冻伤、皮肤老化及抗老化等实验，同时也为脱发研究提供了理想的大动物模型，对我国的生物医药研究有着重大意义。通常可通过如下方法获得‘种新的实验动物品系(如白花或无毛)：从自然出生的动物中筛选出具有突变表型的个体，然后进行近交繁育，最终获得具有此表型的新品系，前面提及的豫医无毛小鼠和无毛豚鼠都是通过这种方法培育的。但是对于大型实验动物来讲，通过如上方法获得具有突变表型的个体，并进而培育成新的品系，是非常困难的和不太现实的。已有研究发现，皮肤特异性过表达小鼠DKKl转基因(其表达受人皮肤特异性的K14启动子调控)的转基因小鼠皮肤无毛(即获得了无毛小鼠)，这是由于皮肤特异性过表达DKKl转

6、基因导致小鼠毛发发育受阻，而该转基因小鼠的其它方面情况正常。大量研究表明，在人和高等动物(如小鼠和猪等)的发育过程中，不同物种问的同一基因(如DKKl)的编码序列高度同源，这决定其功能在不同物种间往往是保守的。猪DKKl基因的编码序列与人和小鼠的高度同源，这些预示DKKI基因的功能在人、猪和小鼠等间亦是保守的(即功能相同)，这提示在转基因猪的皮肤特异性过表达猪DKKl转基因，亦有可能导致该II——一．塑主堂堡垒圣——______。-。-____--_-_。-。__________。_。____●_____________________________________-__________-

7、___●。。__--。。●。●。-。。’’’’—’—————————DKKl转基因猪毛发发育受阻而变得无毛，从而获得无毛猪。此外，采用慢病毒载体法制备了皮肤特异性表达绿色荧光蛋fh(GFP)基因(GFP表达受人皮肤特异性的K14启动子调控)的转基因猪，证实人K14启动子在猪上能正常工作，且GFP基因的表达被限定在猪皮肤，而其它组织无GFP表达，这预示人K14启动子能控制其所调控的转基因在猪皮肤组织特异性表达。