变形链球菌及毒力因子spap、gtf的荧光原位杂交与荧光定量pcr检测

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1、中山大学硕士论文变形链球菌及毒力因子spap、gtf的荧光原位杂交与荧光定量PCR检测专业：口腔临床医学硕士生：刘丽敏指导教师：凌均柒教授中文摘要龋病是在细菌感染等多种因素共同作用下发生的慢性、进行性、破坏性疾病，变形链球菌是主要致龋菌。变形链球菌致龋相关特性有粘附、产酸、耐酸性等，变形链球菌首先粘附到牙齿表面后，才能进～步发挥致龋作用。参与变形链球菌粘附的关键毒力因子是表面蛋I刍(surfaceproteinantigen，SpaP)矛D葡糖基转移酶(glucosyltransferases，GTF)。含spap和gtf序列的变形链球菌具有较强粘附性，因此

2、，菌斑内毒力因子阳性菌的含量能够较为客观地反映细菌致龋活性。本研究采用荧光原位杂交(fluorescentinsituhybridization，FISH)和荧光定量PCR(fluorescentquantitativePCR，FQ—PCR)技术检测变形链球菌及毒力因子含量，以期为龋病风险预测提供实验依据。目的：通过检测菌斑内变形链球菌及表面蛋白和葡糖基转移酶含量，分析变形链球菌及其毒力因子与龋病发生的关系。方法：①通过genbank数据库检索变形链球菌标准菌株UAl59及spap和百f基因序列。对spap和gtf序列进行同源性比较，同时分析序列的发夹和二级

3、结构i将设计完成的毒力因子探针与变形链球菌属标准菌进行杂交，进而检测毒力因子探针的特异性。②选择50例菌斑，10倍系列稀释后涂布于TYCSB和BHI培养基上，厌氧培养48小时后凝胶成像系统进行菌落自动计数。③利用特异荧光探针，结合流式细胞仪，对22例菌斑中变形链球菌及毒力因子含量进行分选检测。④建立gtf扩增标准曲线后，对口腔菌斑中的变形链球菌DNA进行FQ．PCR扩增，确定菌斑中变形链球菌的检出率和gtf拷贝数。利用统计学软件SPSSl0．0，对结果进行统计学分析，在O=O．05水平有统计学意义。结果：①毒力园子(spap和掣f)探针和变形链球菌特异性探针

4、与变形链球菌标准株UAl59和OMZl75特异性结合，与其它细菌则无结合。②常规培养方法检测发现菌斑内变形链球菌在总菌中的比例在有龋和无龋菌斑中变形链球菌比例分别为59％，51％，差异无统计学意义(Jp=O．19)。③FISH技术检测变形链球菌的比例在有龋和无龋菌斑中变形链球菌比例分别为49％，32％，差异有统计学意义俨=O01)。毒力因子spap在有龋和无龋菌斑中平均秩次为15．14和513，差异有统计学意义(P

5、的检出率为76％，无龋菌斑内变形链球菌检出率为47％，差异有统计学意义(P=0．04)。有龋菌斑中垂f的拷贝数平均秩次为2970，无龋菌斑中gtf的拷贝数平均秩次为17．35，差异有统计学意义垆=O．04)。结论：①本研究所设计的spap、gtf探针具有较理想的特异性与敏感性，能进一步应用于口腔变形链球菌FISH检测②有龋患者菌斑内含毒力因子变形链球菌在全菌中比例明显高于无龋者，为判断龋病发生的风险性提供实验依据③荧光原位杂交技术快速、准确地分析菌斑细菌分布情况，为口腔流行病学调查提供新的可靠的检测手段。关键词：变形链球菌表面蛋白葡糖基转移酶荧光原位杂交荧光

6、定量PCR】】中山大学硕士论文DetectionofS．mutansandspap、gtfinDentalPlaquewithFISHandFQ—PCRMajor：StomatologyName：LIULj-minSupervisor：Prof．LINGJun-qiABSTRACTDentalcariesiswidespreadallovertheworld．Cariesiscausedbymultiplefactors，includingbacteria，food，host，andSOon．ItiswellknownthatSmutansisoneofth

7、emajoraetiologicalagentsofdentalcaries．Surfaceproteinantigen(SpaP)andglucosyltransferases(GTF)havealreadybeenprovedtObecrucialadhesionandcolonizationfactorsforS?IIutaFIs．0bject：ToanalysetherelationshipbetweenthecariesandSm“胁聍salongwithitspoisonousfactorsbydetectingtheirpercentage．M

8、ethod：@ThegenesequencesofU