荧光定量pcr的原理及应用

《荧光定量pcr的原理及应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、大型仪器管理中心黄雪玲2010-9-27实时荧光定量PCR原理及其应用荧光定量PCR仪的应用基础研究中基因表达丰度的测定；差异基因的表达检测，基因型分析；临床医疗领域病原体的检测和基因诊断：包括特定基因的检测、细菌和病毒等病原体的检测；环境监测，包括水质、空气的污染检验；检验检疫工作：食品卫生检验，转基因作物的检验；法医的遗传学鉴定；PCR的反应过程CycleFluorescence实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR（Real-timeQ-PCR）技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测整个PCR进程，最后通过参照标

2、准曲线对反应体系中未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR中的三个概念增长曲线(primarycurve)荧光阈值（threshold)CT值(CycleThreshold)增长曲线反映荧光强度与循环数的对应关系CycleFluorescence域值：PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期时的荧光值。荧光域值（Threshold）的设定Ct值Ct值:C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始

3、拷贝数越多，CT值越小；模板DNA的起始拷贝数越少，CT值越大。一般正常的CT值范围在15-35之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。荧光定量PCR标记方法内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针TaqmanMolecularBeaconsDualProbes(FRET)引物特异性探针Amplifluor(Intergen)5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenISYBRGreen®I优点：使用

4、方便，可以应用于不同的模板灵敏，便宜缺点：与非特异性产物结合，但可以通过熔解曲线进行辨别熔解温度(Tm值)Tm值：50%DNA变成单链时的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表序列的特异性。MeltCurveAnalysisRQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation双标记探针（TaqmanProbe）优点：对目标序列有很高的特异性，在病原微生物特异性检测上有独特优势设计简单，准确性好缺点：只适合于一种特异目标的检测，相对价格略高双标记探针（TaqmanProbe）荧光定量PCR实验技

5、术路线查询目的基因序列选择合适的荧光标记方法选染料法则购买SyBrGreenI或相应试剂盒；探针法则设计并合成荧光探针设计特异引物或探针引物设计的一般原则：产物长度在80-300bp之间产物GC含量在50-60%之间引物的GC含量在50-60%之间，熔解温度在55-65℃之间应避免引物中有连续的G或C，但推荐在引物的末端含有G或CPrimer5.0http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/PrimerQuest/Default.aspx?SequenceWarning=True荧光定量PCR实验技术路

6、线实验时先对普通PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在条带特异的情况下才能采用染料法进行荧光定量PCR实验注意模板浓度：在普通PCR基础上可以稀释10~100倍引物浓度：0.4~0.9µM（一般略低于PCR引物量）荧光物质浓度：按说明书操作，根据实验结果优化加样准确性：避免微小加样荧光定量PCR实验技术路线模板PlasmidDNA目的片段在PlasmidDNA中很易被扩增，可以适当稀释TotalDNA目的片段在TotalDNA中丰度相对较低，因此TotalDNA量要略高于PlasmidDNAcDNA以cDNA为模板时一般将反转录产物原液稀释10~5

7、0倍后作模板荧光定量PCR实验技术路线荧光定量PCR反应灵敏，微小差异都能被反映，实验中要避免核酸污染，尤其是避免PCR产物污染。试剂反复冻融对实验也有影响，各组分采用少量分装保存低浓度模板反复冻融容易降解，少量分装保存定量方法绝对定量相对定量标准曲线由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线计算待测样品的浓度logN0=-CtlogE+logN绝对定量——未知浓度的样品与标准曲线相比较绝对定量标准品：含有目的片段的浓度已知的核酸绘制标准曲线时，一般选取4-5个点（多于5个更好），被选点的模板浓度范围要包括待测样本浓度相对定量——在一定样本中靶基因相对

8、于另一参照样本的量的变化只需要了解相对于参照样本目的基因的表达量的变化量，而不需要确切的知道基因的表达量具体是多少，采用相对定量即可。比